Les coliformes totaux

7.0 Méthodes d'analyse pour la détection des coliformes totaux

Au Canada, on utilise actuellement trois méthodes différentes pour détecter de façon régulière la présence de coliformes totaux dans l'eau : la méthode présence-absence (P-A), la filtration sur membrane (FM) et la fermentation multitube (FMT). La 20^e édition de Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (APHA et coll., 1998) présente une description détaillée de ces méthodes.

Les trois méthodes de détection reposent sur la culture pour détecter ou confirmer la présence de coliformes totaux. On peut classer les milieux de culture en deux catégories : les milieux contenant des enzymes bactériennes, destinés à détecter et à confirmer spécifiquement la présence de coliformes totaux en une seule étape (Feng et Hartman, 1982; Ley et coll., 1988) et les milieux de détection de la présence présumée de coliformes, qui exigent une deuxième étape pour confirmer la présence de coliformes totaux.

Les méthodes qui détectent et confirment la présence de coliformes totaux en une seule étape sont basées sur l'utilisation de l'enzyme β-galactosidase. Par définition, toutes les bactéries qui contiennent l'enzyme β-galactosidase appartiennent au groupe des coliformes totaux (APHA et coll., 1998). Une méthode répandue utilise l'activité de la β-galactosidaseprovoquée par les coliformes totaux pour hydrolyser un substrat chromogène, par exemple l'ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside, dans le milieu pour produire de l'ortho-nitrophénol (jaune), qui fait virer le milieu au jaune. Lorsque le milieu vire au jaune, il indique donc la présence de coliformes totaux. Ces nouvelles méthodes fondées sur les enzymes peuvent aussi détecter simultanément les coliformes totaux et E. coli (Edberg et coll., 1988).

Les méthodes fondées sur les enzymes offrent un avantage particulier, puisqu'elles ne nécessitent pas une étape de confirmation. Certaines d'entre elles, telles que les méthodes qui utilisent des substrats définis, inhibent la croissance des bactéries non coliformes, qui ne peuvent donc pas nuire à la récupération des coliformes. Dans les méthodes à substrats définis, seul le micro-organisme cible, les coliformes totaux en l'occurrence, peut trouver des nutriments vitaux dans le milieu employé (Rompré et coll., 2002). C'est pourquoi il faut en encourager l'utilisation.

Pour la détection de la présence de coliformes totaux, on peut utiliser des milieux indicateurs de la présence présumée de coliformes, comme le bouillon de lauryl tryptose et les milieux m-Endo ou LES Endo (APHA et coll., 1998). Lorsqu'on utilise des milieux à base de lactose pour le test P-A ou la méthode FMT, la formation d'acide ou de gaz après une incubation pouvant atteindre 24 heures à 35 °C constitue un résultat positif indiquant la présence présumée de coliformes totaux. Il faudra peut-être procéder à des analyses supplémentaires pour confirmer la présence de coliformes totaux. Dans la procédure FM, les caractéristiques de la colonie, comme la couleur et la brillance en surface, servent à en établir la présence présumée (APHA et coll., 1998). D'autres méthodes de vérification des coliformes totaux récupérés au moyen de la technique FM ont été décrites (Evans et coll., 1981b; Standridge et Delfino, 1982; LeChevallier et coll., 1983b).

Toutes les analyses de détection des coliformes totaux doivent être effectuées conformément aux instructions des autorités compétentes. Dans de nombreux cas, celles-ci recommandent ou exigent le recours à des laboratoires accrédités. Dans certains cas, il peut être nécessaire d'utiliser d'autres moyens, comme les laboratoires non accrédités ou les trousses d'essai commerciales, pour analyser les échantillons rapidement. À des fins de contrôle de qualité, des échantillons de validation doivent alors être envoyés à des laboratoires accrédités pour y être analysés; si cela n'est matériellement pas possible, il faut procéder à l'analyse d'échantillons supplémentaires à l'aide de la trousse d'essai. Les conditions de l'échantillonnage de validation doivent être définies par les autorités compétentes. De plus, toutes les trousses d'essai utilisées doivent remplir les conditions minimales de précision et de détection (sensibilité) requises; de même, l'opérateur doit s'assurer que le matériel est régulièrement étalonné et que les trousses d'essai sont utilisées avant leur date de péremption.

7.1 Méthode présence-absence

Le test P-A est une méthode qualitative que l'on a mise au point comme moyen sensible, économique et efficace d'analyser des échantillons d'eau potable (Clark et Vlassoff, 1973). Il s'agit essentiellement d'une modification de la technique de fermentation multitube (voir la section 7.3 ci-dessous) au cours de laquelle on utilise une seule bouteille d'analyse par échantillon. Elle n'est donc recommandée que pour l'analyse d'un approvisionnement en eau où l'on a prélevé une série d'échantillons séquentiels ou consécutifs. Dans un échantillon d'eau type de 100 ml, la limite de détection de la méthode s'établit à un organisme par 100 ml. Cette sensibilité équivaut à celle des méthodes classiques FMT et FM. On a aussi démontré que cette méthode permettait de détecter des coliformes qui ont subi des lésions pendant la période de réponse de 24 heures (Rompré et coll., 2002). Cette méthode peut servir avec les milieux à base d'enzymes, tels que les milieux à substrat défini, ou avec les milieux de détection de la présence présumée de coliformes (p. ex., bouillon de lauryl tryptose), qui nécessitent une étape de confirmation. On a mis au point des trousses d'essai commerciales qui utilisent des méthodes à substrat défini.

Au cours d'essais comparatifs, on a montré que la méthode P-A était au moins aussi sensible que la technique FM pour la récupération des coliformes dans des échantillons d'eau potable (Clark, 1980; Jacobs et coll., 1986; Pipes et coll., 1986). Une évaluation nationale réalisée aux États-Unis a en outre démontré qu'il n'y avait aucune différence statistique entre le nombre d'échantillons positifs pour les coliformes obtenus par la méthode FMT standard et les résultats de la méthode P-A fondée sur des milieux à substrat défini (Edberg et coll., 1989). Sur le plan technique, le test P-A est plus simple que les méthodes FM et FMT, car il faut moins d'une minute pour analyser chaque échantillon. La nature qualitative et le besoin de confirmer des résultats positifs (dans le cas du bouillon de lactose seulement) sont les seules lacunes du test P-A. Comme les coliformes totaux sont des indicateurs opérationnels, les résultats quantitatifs des méthodes d'analyse FM ou FMT seront plus informatifs.

7.2 Filtration sur membrane

On a adopté la technique FM pour l'analyse bactériologique de l'eau en 1951 après que l'on a démontré qu'elle pouvait donner des résultats comparables à ceux de la méthode FMT (Clark et coll., 1951; Goetz et Tsuneishi, 1951). Il s'agit d'une méthode quantitative fondée sur des membranes filtrantes dont les pores peuvent retenir les organismes cibles. On filtre l'échantillon d'eau sur la membrane, que l'on transfère ensuite sur un milieu de croissance approprié pour identification et quantification. Cette méthode présente l'avantage de permettre d'analyser des volumes plus importants que la méthode FMT; elle offre en outre une sensibilité et une fiabilité plus grandes tout en réduisant considérablement le temps, la main-d'oeuvre, le matériel, l'espace et les fournitures nécessaires. En raison de ces qualités, la technique FM demeure, dans certains secteurs de compétence, la méthode de choix pour le dénombrement régulier des coliformes dans l'eau potable. Elle présente cependant un inconvénient : on ne peut l'utiliser sur des échantillons d'eau à forte turbidité. Les particules retenues par le filtre peuvent gêner le développement des colonies et la production de reflets à la surface qui permettent de détecter visuellement la présence de colonies de coliformes.

Le principal problème de cette méthode et des techniques fondées sur l'utilisation de milieux sélectifs qui engendrent un stress (c.-à-d. des milieux contenant des produits chimiques inhibiteurs des organismes non visés), c'est qu'elles ne permettent pas de dénombrer les coliformes qui ont subi des lésions sublétales (par chloration, p. ex.) à l'usine de traitement ou dans le réseau de distribution. Il arrive souvent que les micro-organismes ayant subi un stress ne parviennent pas à se multiplier dans les milieux sélectifs pour coliformes, mais ils peuvent se rétablir grâce à un processus de revivification. Des expériences ont montré que jusqu'à 90 % des coliformes totaux présents pouvaient avoir subi des lésions (Clark et coll., 1951). La mise au point d'un nouveau milieu (m-T7) qui améliore la récupération des coliformes ayant subi un stress dans l'eau potable a constitué une amélioration importante de la technique FM (LeChevallier et coll., 1983a). L'évaluation de milieux utilisant des échantillons d'eau potable courants (LeChevallier et coll., 1983b; McFeters et coll., 1986) et des échantillons d'eau de surface (McFeters et coll., 1986; Freier et Hartman, 1987) a montré que la récupération de coliformes était plus élevée dans le milieu m-T7 que dans le milieu m-Endo. Dans tous les cas ci-dessus, on a utilisé du chlore comme agent agresseur. Des travaux au cours desquels on a utilisé des échantillons monochloraminés (Rice et coll., 1987) et ozonés (Adams et coll., 1989) ont montré que le milieu m-T7 n'a pas donné de meilleurs résultats que la gélose m- Endo pour dénombrer E. coli et Citrobacter freundii.

Comme on l'a signalé ci-dessus, des bactéries non coliformes peuvent nuire à la récupération des coliformes dans un milieu à base de lactose. Des données tirées de la U.S. National Community Supply Survey (Geldreich et coll., 1972) ont montré que la récupération des coliformes totaux par la technique FM diminuait à mesure que la concentration de bactéries hétérotrophes déterminée augmentait. On a observé la réduction la plus importante lorsque les concentrations de bactéries hétérotrophes dépassaient 500 unités formant colonies (ufc)/ml. Des chercheurs ont montré que la composition de la flore hétérotrophe pouvait aussi être importante. Burlingame et coll. (1984) ont montré que la présence de Pseudomonas aeruginosa (30 ufc/ml) et d'A. hydrophila (2 ufc/ml) entraînait une diminution importante de la production de reflets par les coliformes dans la gélose m-Endo LES. Par contre, Flavobacterium sp. et Bacillus sp. n'avaient pas d'effet inhibiteur sur les coliformes, même à des concentrations de plus de 1 000 ufc/ml. Standridge et Sonzogni (1988) ont évalué deux modifications de la technique FM pour la recherche des coliformes totaux dans l'eau potable contenant une flore secondaire abondante. Dans les deux cas, environ 8 % des milieux classés au début comme négatifs, mais présentant une croissance excessive, c.-à-d. une croissance confluente ou supérieure à 100 ufc secondaires par 100 ml, ont donné des coliformes. Il convient de signaler que dans la plupart des approvisionnements en eau où l'on maintient une concentration résiduelle totale de chlore de 0,2 mg/l, la concentration des bactéries hétérotrophes n'atteint pas 500 ufc/ml

Traditionnellement, dans certains secteurs de compétence, on a utilisé le dénombrement des colonies secondaires sur membrane filtrante pour coliformes totaux comme substitut commode et peu coûteux de la numération des bactéries hétérotrophes. Le dénombrement des colonies secondaires ne doit plus être employé comme substitut de la numération des bactéries hétérotrophes, mais peut être utile pour déterminer si les concentrations de bactéries hétérotrophes présentes peuvent nuire à la récupération des coliformes. Le document Recommandations pour la qualité de l'eau potable au Canada : document technique - Les bactéries hétérotrophes (Santé Canada, 2006b) contient d'autres renseignements sur la numération des bactéries hétérotrophes et des colonies secondaires, ainsi que sur l'importance pour la santé publique de leur présence dans l'eau potable.

7.3 Fermentation multitube

La technique de fermentation multitube (FMT) manque de précision, est plus difficile à appliquer et produit des résultats moins rapidement que la technique de filtration sur membrane (FM), qui l'a donc remplacée dans une grande mesure pour les analyses régulières de l'eau potable. La FMT demeure toutefois utile comme méthode comparative ou lorsque les conditions ne permettent pas d'utiliser la technique FM : en présence d'eau trouble, colorée ou très contaminée, par exemple.

Dans la méthode FMT, on ajoute de l'eau à analyser, diluée à un coefficient de 10, dans des éprouvettes contenant les milieux appropriés (5 ou 10 éprouvettes par dilution) et l'on fait incuber. On peut utiliser aussi bien des milieux à base d'enzymes que des milieux de détection de la présence présumée de coliformes. Il ne devrait pas être nécessaire de diluer l'eau potable parce qu'on s'attend à ce que les valeurs de dénombrement soient faibles. Lorsqu'on utilise des milieux à base d'enzymes, le recours à une étape de confirmation n'est pas nécessaire. En effet, comme on l'a mentionné ci-dessus, la couleur des milieux contenant l'enzyme β-galactosidase propre aux coliformes change de façon spécifique pour indiquer la présence confirmée de coliformes totaux. Lorsqu'on utilise des milieux de détection de la présence présumée de coliformes, il faut procéder à des analyses supplémentaires pour confirmer la présence de coliformes totaux. On peut, par exemple, confirmer la présence de coliformes totaux au moyen d'un bouillon lactosé bilié au vert brillant. La formation de gaz dans cette éprouvette de fermentation dans les 48 heures à une température de 35 ° constitue une confirmation positive (Rompré et coll., 2002). Les résultats sont exprimés sous forme de nombre le plus probable (NPP), quel que soit le type de milieu utilisé. Le NPP représente une estimation statistique seulement du nombre de bactéries qui, plus probablement qu'un autre, donnerait les résultats observés. Il ne s'agit pas du nombre réel de bactéries présentes. Des trousses commerciales pour la détermination du NPP sont disponibles. Les plus répandues utilisent des plaques à cupules contenant un milieu spécifique et l'enzyme β-galactosidase. On ajoute un échantillon d'eau à la plaque. Les cupules qui contiennent des coliformes totaux subissent un changement de couleur spécifique. Le nombre de cupules positives est alors utilisé pour calculer le NPP.

Les densités élevées de non-coliformes et la nature inhibitrice de certains des milieux utilisés pour la technique FMT peuvent avoir un effet défavorable sur les méthodes habituelles de surveillance des coliformes. Seidler et coll. (1981) ont montré que la récupération des coliformes totaux par la technique FMT diminuait avec l'augmentation de la concentration de bactéries hétérotrophes et que la réduction la plus importante survenait lorsque les concentrations de bactéries hétérotrophes dépassaient 250 ufc/ml. Le Chevallier et McFeters (1985) ont posé comme hypothèse que la concurrence dont le carbone organique est l'objet et qui constitue un facteur limitatif était à l'origine de cet effet des bactéries hétérotrophes sur la récupération des coliformes totaux. La récupération de coliformes à partir de tubes FMT ayant donné des résultats négatifs quant à la production de gaz, mais présentant une certaine turbidité, a démontré la présence de composés inhibiteurs dans les milieux FMT. Lorsque l'on utilisait comme milieu primaire le bouillon de lauryl-tryptose, l'isolement de coliformes dans des tubes troubles ayant donné des résultats négatifs quant à la production de gaz augmentait le nombre de tubes positifs dans une analyse FMT d'une proportion pouvant aller jusqu'à 28 % (McFeters et coll., 1982). Des études comparatives réalisées avec du bouillon lactosé bilié au vert brillant et de la gélose m-Endo LES comme milieux de confirmation ont également démontré que le bouillon lactosé bilié au vert brillant pouvait inhiber la croissance de certains coliformes. Evans et coll. (1981a) ont mis au point une méthode pour déceler les réactions faussement négatives. Une technique FMT modifiée a doublé la fréquence de détection des coliformes comparativement à la méthode standard pour l'eau potable. C'est pourquoi l'on recommande, dans l'édition actuelle des Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (APHA et coll., 1998), de considérer que tous les tubes présentant une turbidité, qu'il y ait ou non production de gaz, indiquent la présence présumée de coliformes.