Les toxines cyanobactériennes -- Les microcystines-LR

Effets sur la santé

Les algues bleues présentes dans les lacs, les étangs et les étangs artificiels provoquent des intoxications chez les animaux et chez les êtres humains dans diverses ré-gions du monde depuis plus de 100 ans.

Effets sur les êtres humains

Eaux utilisées à des fins récréatives

On a établi un lien entre l'utilisation à des fins ré-créatives d'eaux contaminées par des proliférations cya-nobactériennes comme Anabaena et Microcystis et des maladies (mais aucun décès) chez les êtres humains en Amérique du Nord, au Royaume-Uni, aux Pays-Bas et en Australie. Au Canada, on a signalé en Saskatchewan des cas de maladie, dont les symptômes comprenaient des crampes abdominales, des vomissements, la diarrhée, la fièvre, des céphalées, des douleurs musculai-res et articulaires et la faiblesse⁶³. On a signalé aussi ail-leurs des symptômes semblables, ainsi qu'une irritation cutanée, une rougeur oculaire douloureuse, des maux de gorge et des réactions allergiques⁶. Les cas déclarés de maladie sont peu nombreux, mais comme elles sont dif-ficiles à diagnostiquer, ces maladies peuvent être plus courantes que cela ne semble être le cas⁶⁴.

L'exposition s'est faite principalement par contact cutané et par ingestion par inadvertance d'eau contenant des cyanobactéries dispersées. Même si les toxines cya-nobactériennes sont très toxiques pour les animaux, il est rare que l'on signale chez les êtres humains des maladies aiguës graves attribuables à ces toxines. C'est probablement parce que l'ingestion d'écume d'algues rebute aux êtres humains.

Au cours d'un incident survenu récemment au Royaume-Uni dans le cadre d'un exercice militaire mené dans un réservoir présentant une fleur d'eau de Microcystis aeruginosa, 10 recrues sur 18 ont souffert de douleurs abdominales, de nausées, de vomissements, de diarrhée, de maux de gorge, de toux sèche, d'ampoules à la bouche et de céphalées. Deux d'entre elles ont été hospitalisées et ont été victimes d'une pneu-monie atypique, même s'il se peut que la pneumonie ait été causée par l'inspiration de matière d'algue qui a pu contenir aussi des lipopolysaccharides. Les concentrations d'enzymes sériques indiquant une atteinte hépa-tique étaient élevées. On a identifié la microcystine-LR dans la matière de la fleur d'eau⁶⁵.

Eau potable

Aux États-Unis et en Australie, on a incriminé plu-sieurs toxines cyanobactériennes différentes dans des incidences de maladies chez les êtres humains, surve-nues souvent après le traitement au sulfate de cuivre de proliférations d'algues dans certains approvisionnements d'eau municipaux^6,66,67. Même si l'on n'a pas établi de lien direct de cause à effet dans la plupart des éclosions de maladies, les preuves indirectes de la présence de proliférations de cyanobactéries dans les zones de prise d'eau ou dans les réservoirs à ciel ouvert étaient nom-breuses. Même si, dans la plupart des cas, on a identifié les cyanobactéries et parfois les toxines incriminées, on n'a établi dans aucun des cas les concentrations de toxines associées à la maladie. Dans le cas d'au moins une éclosion survenue en 1979⁶⁸ à Palm Island, en Australie, on a suggéré comme autre cause possible une intoxication aigue au cuivre⁶⁹, même si une étude plus poussée a révélé qu'une toxine produite par une espèce d'algues bleues (Cylindrospermopsis raciborskii) a pu être l'agent pathogène⁷. Dans le cas en question, des plaintes portant sur le mauvais goût et la mauvaise odeur d'un approvisionnement d'eau, que l'on a attribués à une pro-lifération de cyanobactéries, a incité les autorités à trai-ter le réservoir au sulfate de cuivre. En moins d'une semaine, de nombreux enfants étaient aux prises avec une hépatoentérite sérieuse et il a fallu hospitaliser 140 enfants et 10 adultes. On n'a signalé aucun décès.

Des lésions hépatiques possibles, indiquées par des lévations importantes de la --glutamyl-transférase, ont té observées chez des personnes qui consommaient de l'eau potable provenant d'approvisionnements contenant des fleurs d'eau de Microcystis après traitement au sulfate de cuivre (Malpas Dam, Armidale, en Australie) par rapport aux personnes qui consommaient de l'eau potable non contaminée⁷⁰.

Jusqu'à maintenant, l'éclosion la plus mortelle attribuée à l'exposition des toxines cyanobactériennes présentes dans l'eau potable est survenue au Brésil en 1988⁷¹. Une immense fleur d'eau cyanobactérienne a fait son apparition dans un réservoir que l'on venait d'inon-der derrière un barrage et a causé plus de 2 000 cas de gastroentérite. On a signalé 88 décès (surtout des en-fants) en 42 jours. Il semble que la prolifération de cya-nobactéries provenait de biomasse en décomposition et d'autres conditions qui prévalaient dans la région du ré-servoir nouvellement inondé.

On a signalé plus récemment, soit en février 1996, des cas d'insuffisance hépatique et de décès chez des patients qui ont subi une hématolyse à une clinique bré-silienne de dialyse où l'on a constaté que le dialyseur était contaminé par des fragments de cellules d'algues microscopiques et de cyanobactéries, et probablement par la microcystine-LR, une toxine^72,73. On a signalé qu'environ 50 % des patients dialysés exposés au dialy-sat contaminé étaient morts. Il n'y avait toutefois pas de renseignements disponibles sur le type, l'abondance et la toxicité des cyanobactéries présentes dans le réservoir d'où provenait l'eau en cause pendant la période en question. Une histologie du foie a confirmé la présence d'une hépatite toxique aigue semblable à celle qu'on a observée chez des animaux exposés aux microcystines. L'analyse de tissus hépatiques et d'échantillons de sérum de patients, ainsi que du filtre au charbon de l'appareil de dialyse, ont confirmé la présence de trois dérivés des microcystines (YR, LR et AR). On a conclu qu'un traitement supplémentaire inadéquat de l'eau uti-lisée dans la dialyse à la clinique était la cause la plus probable de la présence des toxines dans le dialysat et que l'exposition à ces microcystines par voie intravei-neuse a beaucoup contribué au décès des patients en cause⁷⁴. En se fondant sur une analyse plus poussée du phytoplancton provenant du centre de dialyse, ainsi que d'échantillons de tissus et de sérums provenant des 76 victimes et d'autres patients touchés, on a estimé que l'eau utilisée dans le traitement par dialyse contenait 19,5 µg de microcystine/L⁷⁴. Comme les patients en dia-lyse sont vulnérables aux dialysats contaminés, il faut informer les centres de dialyse si l'eau de leur usine de traitement locale est vulnérable aux proliférations d'algues bleues afin qu'ils puissent prévoir un traitement supplémentaire de l'eau au besoin. Il faut aussi contrôler continuellement le rendement de l'usine de traitement et de l'équipement pour assurer que l'approvisionnement d'eau est adéquat.

Zilberg⁷⁵ a posé comme hypothèse que la gastro-entérite aiguë saisonnière infantile que l'on a observée au cours de la période de 1960 à 1965 à Salisbury, en Rhodésie (maintenant Harare, au Zimbabwe), pourrait être reliée à des proliférations annuelles d'algues dans le lac qui sert de source d'approvisionnement en eau. Une source d'approvisionnement en eau adjacente n'a pas été atteinte de la même manière et n'a pas été associée à cette maladie.

El Saadi et Cameron⁷⁶ ont signalé 26 cas (âgés de 1 à 64 ans) présentant tout un éventail de symptômes associés à l'exposition, en 1991-1992, à des eaux de ri-vière ou de pluie (River Murray, en Australie) stockées dans des bassins ouverts et contenant des fleurs d'eau d'Anabaena. Diarrhée, vomissements, nausées, faiblesse musculaire, maux de gorge, difficultés respiratoires et céphalées étaient au nombre des symptômes qui ont suivi l'ingestion (eau potable). Après un contact cutané (activités récréatives) ou un contact avec la muqueuse buccale, on s'est plaint notamment d'éruptions cutanées, de démangeaisons, de l'apparition d'ampoules à la bouche et d'une irritation des yeux. Des études cas-témoins supplémentaires se poursuivent dans la même région.

On a signalé des proliférations de cyanobactéries dans des eaux de surface utilisées pour la consommation en Chine, où l'incidence des cancers primitifs du foie est élevée. On manque toutefois de données⁶. Au cours d'une étude épidémiologique sur le cancer primitif du foie chez les êtres humains réalisée par Yu⁷⁷ dans le comté de Qidong, en Chine, on a constaté que l'inci-dence de cancers du foie était environ huit fois plus élevée chez les personnes qui consommaient de l'eau d'étang ou de fossé que chez celles qui consommaient de l'eau de puits (on n'a pas établi les concentrations de toxines d'algues). Des analyses épidémiologiques plus poussées s'imposent pour clarifier le rôle possible (sup-plémentaire) des microcystines dans cette maladie à étiologie multifactorielle. L'infection par le virus de l'hépatite B et l'exposition alimentaire à l'aflatoxine B₁ sont deux facteurs de risque connus pour le cancer du foie et présents dans la même région de la Chine.

Junshi⁷⁸ n'a pas observé de lien semblable au cours d'une étude épidémiologique plus importante sur le cancer primitif du foie réalisée dans 65 comtés de la Chine. Au cours de cette étude, on a établi un lien direct entre l'utilisation d'eau de puits profonds et le cancer du foie, ce qui va à l'encontre des résultats de Yu⁷⁷.

Au cours d'une étude épidémiologique plus récente menée dans la ville de Haimen (province du Jian-Su) et dans le comté de Fusui (province du Guangxi) en Chine, Ueno et al.⁷⁹ ont constaté qu'il y avait un lien étroit entre l'incidence de cancers primitifs du foie et l'utilisation d'eau potable provenant d'étangs et de fossés. On a combiné la méthode ELISA et la chromatographie d'affinité sur colonne pour détecter (limite de détection de 0,05 µg/L) de très faibles concentrations de micro-cystines dans les échantillons d'eau non purifiés ni concentrés (pour la méthode, voir Nagata et al.⁸⁰). En septembre 1993, trois échantillons d'eau de fossé sur quatorze contenaient des microcystines en concentrations variant de 0,09 à 0,46 µg/L. On a ensuite prélevé des échantillons mensuels dans cinq étangs/fossés, deux rivières, deux puits peu profonds et deux puits profonds pendant toute l'année 1994. Les données ont montré que les concentrations de microcystines les plus élevées apparaissaient de juin à septembre, et que leur plage s'étendait de 0,058 à 0,296 µg/L. Un troisième essai réa-lisé sur les 989 échantillons d'eau prélevés dans les dif-férentes sources d'eau en juillet 1994 a révélé que 17 % des eaux d'étang/de fossé, 32 % des eaux de rivière et 4 % des eaux de puits peu profonds contenaient des microcystines, à des concentrations moyennes de 0,1, 0,16 et 0,068 µg/L respectivement. On n'a pas détecté de microcystines dans l'eau de puits profonds. Une étude semblable réalisée sur 26 échantillons d'eau potable dans la province du Guangxi a montré qu'il y avait sou-vent des microcystines dans l'eau d'étang/de fossé et de rivière, mais on n'en a pas détecté dans les eaux de puits profonds ou peu profonds.

Pilotto et al.⁸¹ ont étudié le lien entre l'exposition possible à des toxines cyanobactériennes présentes dans l'eau potable au cours de la grossesse et des résultats à la naissance. Les chercheurs ont analysé plus de 32 000 naissances vivantes simples entre 1992 et 1994 dans 156 collectivités australiennes. Même s'ils ont observé des différences importantes entre l'expo-sition aux cyanobactéries (estimation fondée sur la pré-sence de cyanobactéries et la densité des cellules dans l'eau potable) au cours du premier trimestre et les incidences de faible et de très faible poids à la naissance, les résultats n'indiquent pas l'existence d'un lien de cause à effet avec les cyanobactéries. On n'a observé aucune relation de dose à réponse. Les auteurs ont conclu que l'étude ne démontrait pas clairement l'existence d'un lien entre la contamination de réserves d'eau potable par des cyanobactéries et des issues indésirables de la grossesse.

Comme les fleurs d'eau cyanobactériennes ont tendance à réapparaître régulièrement dans le même appro-visionnement d'eau, certaines populations humaines sont exposées à l'ingestion répétée de toxines cyanobactériennes.

Effets sur les animaux

Cinétique et métabolisme

Quoique si l'ingestion constitue la voie la plus probable d'exposition aux toxines cyanobactériennes, les études pharmacocinétiques au cours desquelles on a administré des microcystines par voie orale sont peu nombreuses. Après avoir injecté à des souris et à des rats, par voie intraveineuse ou intrapéritonéale, des doses sublétales de microcystines radiomarquées de façons différentes, environ 70 % des toxines se sont retrouvées rapidement dans le foie^82,87, tandis que l'administration par voie orale a entraîné une absorption de moins de 1 % dans le foie de souris⁸⁷. Même si la microcystine-LR ne traverse pas facilement les membranes cellulaires et ne pénètre pas dans la plupart des tissus, les microcystines semblent être transportées dans les hépatocytes et dans les cellules de la muqueuse intestinale par le système de transport des acides biliaires^88,89. On a constaté aussi que la microcystine-LR traversait l'iléon par l'intermédiaire du système de transport multispécifique des ions organi-ques⁹⁰. Dans les hépatocytes, la microcystine-LR forme une liaison covalente avec une protéine de 40 000 dal-tons (la phosphatase protéique 2A et peut-être la phos-phatase protéique 1) dans le cytosol⁹¹ (pour un résumé, voir Fujiki et Suganuma⁹²). Des congénères de la micro-cystine plus hydrophobes que la microcystine-LR peu-vent traverser des membranes cellulaires par d'autres mécanismes comme la diffusion^7,13.

Les demi-vies de la microcystine-LR dans le plasma après administration par voie intraveineuse ont été de 0,8 et 6,9 minutes pour les phases d'élimination alpha et bêta, mais la concentration du marqueur radioactif (³H-microcystine-LR) dans le foie n'a pas changé au cours de la période d'étude de six jours. L'organisme a excrété rapidement environ 9 % de la dose par voie uri-naire et le reste a été excrété lentement (~1 % par jour) par voie fécale⁸⁵. Si l'on se fonde sur l'effet de protection des inducteurs de l'activité enzymatique microso-male, il est manifeste que le foie joue un rôle important dans la détoxification des microcystines⁸³. On a observé l'apparition et la disparition en fonction du temps de pics supplémentaires qui correspondaient, croit-on, aux produits de détoxification, dans l'urine, dans les fèces et dans les fractions de cytosol du foie⁸⁵. On n'a toutefois pas déterminé la structure de ces produits. À la suite d'une injection intrapéritonéale de microcystine-LR, on a identifié trois produits métaboliques chez les rats et les souris, dont des conjugués de glutathione et de cystéine et un conjugué avec l'ADDA diène oxydé⁹³.

Toxicité aiguë

La microcystine-LR est extrêmement toxique après une exposition aiguë. Des animaux qui avaient consom-mé de l'eau contenant beaucoup (>10⁶/mL) de cellules cyanobactériennes¹ sont morts. La DL₅₀par voie intrapéritonéale est d'environ 25 à 150 µg/kg p.c. chez la souris. La DL₅₀par voie orale (ga-vage) est de 5 000 µg/kg p.c. chez la souris, mais elle est plus élevée chez le rat^94,95. Ce qui indique que, même par voie orale, la microcystine-LR est extrêmement toxique pour les souris après une exposition aiguë. L'injection intrapéritonéale est de 30 à 100 fois plus toxique. Ainsi, une quantité importante de microcystine-LR échappe aux effets des peptidases dans l'estomac et est absorbée.

On a aussi signalé que la DL₅₀par voie orale d'un extrait toxique d'Anabaena chez les souris était d'au moins 170 fois plus élevée que la DL₅₀par voie intrapéritonéale du même extrait⁹⁶. Yoshida et al.⁹⁷ ont signalé que la DL₅₀de la microcystine-LR administrée par voie orale (gavage) (10,0 mg/kg p.c.) chez les souris âgées de six semaines était 167 fois plus élevée que la valeur intra-péritonéale (65,4 µg/kg p.c.). Sur le plan histologique, les deux voies d'administration ont produit des types semblables de lésion aux hépatocytes, y compris l'hémorragie et la nécrose.

La DL₅₀par voie intrapéritonéale de plusieurs des microcystines les plus courantes (microcystines-LA, -YR et -YM) est semblable à celle de la microcystine-LR, mais la DL₅₀par voie intrapéritonéale de la microcystine-RR est environ 10 fois plus élevée^98,99. Comme la lipophilie et la polarité des différentes micro-cystines présentent toutefois des différences, on ne peut pas présumer que la DL₅₀par voie intrapéritonéale permet de prédire la toxicité après administration par voie orale.

Les microcystines sont principalement des hépato-toxines. Après une exposition aiguë par injection intra-veineuse ou intrapéritonéale de microcystines, on a observé une atteinte hépatique grave caractérisée par une perturbation de la structure cellulaire du foie (attribuable aux dommages causés au cytosquelette), une perte de la structure sinusoïdale, une augmentation du poids du foie causée par une hémorragie intrahépatique, un choc hé-modynamique, une insuffisance cardiaque et la mort. Les reins et les poumons sont aussi atteints¹⁰⁰. Les dom-mages à l'intestin sont attribuables au transport des microcystines à travers les cellules de la muqueuse intestinale, qui sont endommagées de la même façon que les hépatocytes⁸⁹.

Toxicité subchronique et chronique

Au cours d'une étude réalisée à Quintiles par le WRc au Royaume-Uni, on a administré de la microcys-tine-LR par voie orale, soit par gavage, à des groupes de 15 souris mâles et de 15 souris femelles, à raison de 0, 40, 200 ou 1 000 µg/kg p.c. par jour pendant 13 semai-nes. Le niveau sans effet nocif observé (NOAEL) pour la toxicité hépatique s'est établi à 40 µg/kg p.c. par jour. À la dose plus élevée suivante, on a observé une pathologie hépatique légère chez une souris mâle et chez deux sou-ris femelles. À la dose la plus élevée, toutes les souris ont présenté des changements hépatiques, y compris une inflammation chronique, une dégénérescence des hépa-tocytes et des dépôts d'hémosidérine. Chez les souris mâles, aux deux doses les plus élevées, l'alanine et l'aspartate aminotransférase ont augmenté considérable-ment, la --glutamyl-transférase sérique a baissé légère-ment et l'on a observé une réduction faible mais significative des concentrations totales de protéines et d'albumines sériques. La phosphatase alcaline a aussi augmenté de façon significative à la dose la plus élevée. Chez les souris femelles qui ont reçu la dose la plus élevée, on a observé une augmentation des concentrations de phosphatase alcaline et d'alanine aminotransfé-rase seulement. La prise de poids corporel a diminué chez les souris mâles de tous les groupes traités, mais on n'a pas constaté de relation dose-réponse et le poids corporel final a diminué de 7 % seulement⁹⁴.

On a réalisé une autre étude en administrant à des souris (410 au total) par voie orale des doses répétées d'extraits de Microcystis aeruginosa à six concentrations (témoin, dilutions à un seizième, à un huitième, à un quart, à la moitié et extrait toxique non dilué; l'extrait non dilué présentait une concentration de toxine de 56,6 µg/mL, estimée au moyen de la valeur de la DL₅₀, qui équivaut approximativement à une dose de 11 300 µg/kg p.c. par jour) dans l'eau potable pendant une année. Le taux de mortalité a augmenté avec la dose aux deux doses les plus élevées. À la dose la plus élevée, le poids corporel a baissé chez les deux sexes après neuf semaines et le poids du foie a augmenté chez les femel-les après cinq semaines. Chez les mâles, le poids du foie a augmenté considérablement par rapport au poids corporel à la dose précédant la dose la plus élevée, mais pas à la dose la plus élevée, en raison de la mortalité élevée et de la perte de poids corporel. Aux deux doses les plus élevées, les concentrations d'alanine amino-transférase étaient élevées après cinq et neuf semaines et une lésion hépatique chronique active était évidente après une exposition maximale de 13 semaines. Après des périodes d'exposition plus longues aux doses moins élevées, on n'a observé aucun changement pathologique dans le foie qui serait directement lié à l'effet de la toxine sur les hépatocytes et l'on n'a constaté la pré-sence d'aucun néoplasme hépatique. On a aussi observé certains signes d'augmentation du nombre des broncho-pneumonies avec l'augmentation des concentrations de l'extrait¹⁰¹.

Ito et al.¹⁰² ont étudié les effets de l'âge sur le foie de souris jeunes et de souris âgées auxquelles on a admi-nistré de la microcystine-LR par voie orale. Vingt-neuf souris ICR mâles de 32 semaines (âgées) et 12 de cinq semaines (jeunes) ont reçu 500 µg/kg p.c. par intubation gastrique. Chaque groupe comportait trois témoins non exposés (âgés et jeunes). On a sacrifié des animaux de chaque groupe après deux, cinq et 19 heures et l'on en a examiné le foie et l'intestin grêle. On a constaté, chez 62 % des souris âgées, la présence d'une lésion hépa-tique que l'on ne pouvait distinguer, sur le plan patholo-gique, des lésions hépatiques causées par l'administra-tion intrapéritonéale, ce qui indique que le foie a incorporé la microcystine-LR après l'administration par voie orale. Le dommage le plus sérieux causé à l'intestin grêle des souris âgées a été observé dans le duodénum. On n'a par ailleurs observé aucun effet, ni dans le foie, ni dans l'intestin, chez les souris jeunes (cinq semaines). On n'a observé aucune différence importante dans le ré-sultats de tests biochimiques (glutamate-oxaloacétate transaminase et glutamate-pyruvate transaminase) ou à l'examen morphologique du foie des souris âgées et des souris jeunes non traitées, ce qui indique que le foie des souris âgées était sain. D'autres tests pratiqués chez les souris âgées et les souris jeunes indiquent que l'absorp-tion de la toxine par la voie orale est reliée à l'état des cellules épithéliales de surface et à l'imperméabilité des capillaires des villosités de l'intestin grêle et qu'il y a un lien solide avec l'âge.

Heinze¹⁰³ a étudié la toxicité de la toxine de micro-cystine-LR pure dans l'eau potable de rats (10 animaux par groupe) exposés à quelque 50 ou 150 µg/kg p.c. par jour pendant 28 jours. On a observé des augmentations liées à la dose du poids relatif du foie et des taux d'enzymes sériques (lactate déshydrogénase et alcaline phosphatase). L'examen histologique des tissus a révélé clairement des dommages au foie, qu'on a définis comme « hépatose toxique ». Les dommages étaient plus graves à la dose plus élevée.

Dans une étude mal décrite, Fitzgeorge et al.¹⁰⁴ ont signalé que l'instillation intranasale de microcystine-LR chez les souris a provoqué une nécrose étendue de l'épithélium de la muqueuse nasale dans les zones olfactive et respiratoire. La nécrose a évolué jusqu'à la destruction d'importantes superficies de muqueuse, pour atteindre le niveau des vaisseaux sanguins profonds. La DL₅₀signalée pour cette voie d'absorption était la même que la DL₅₀de l'administration par voie intrapéritonéale(250 µg/kg p.c.) et on a observé des lésions au foie liées à la dose. Les auteurs ont aussi signalé des dommages hépatiques cumulatifs à la suite de l'administration ré-pétée de doses par voie intranasale. Même si l'on n'a observé aucune augmentation du poids du foie à la suite de l'administration d'une seule dose de 31,3 µg/kg p.c., l'administration quotidienne répétée de la même dose pendant sept jours a provoqué une augmentation de 75 % du poids du foie, effet qui ressemble de très près à celui qu'on a observé à la suite de l'administration d'une seule dose intranasale de 500 µg/kg p.c. (augmentation de 87 % du poids du foie).

Au cours d'une étude subchronique, on a administré des extraits de Microcystis aeruginosa dans l'eau potable de groupes de cinq porcs pendant 44 jours, à des niveaux de dose de microcystine équivalant à 0, 280, 800 et 1 310 µg/kg p.c. par jour (la concentration de l'extrait utilisé était fondée sur sa DL₅₀ par voie intrapéritonéale chez les souris). L'extrait contenait au moins sept variantes de microcystines, la microcystine-YR produisant provisoirement le pic principal. La fonction hépatique (démontrée par les modifications de la --glutamyl-transpeptidase, de la phosphatase alcaline, de la bilirubine totale et de l'albumine plasmatique) a chan-gé aux deux doses les plus élevées, tandis que l'on a ob-servé des lésions hépatiques visibles aux trois doses. Un seul porc a été atteint à la dose la plus faible. Il peut donc être approprié de considérer que le niveau de dose de 280 µg/kg p.c. par jour constitue le niveau le plus faible avec effet nocif observé (LOAEL). Il est possible de calculer des LOAEL d'un ordre de grandeur semblable (variant de 90 à 270 µg/kg p.c. par jour) en se fondant sur la teneur en toxines de l'écume cyanobacté-rienne déshydratée calculée par d'autres laboratoires¹⁰⁵.

Au cours d'une étude de toxicité chronique, on a administré par voie intragastrique de la microcystine-LA pendant 46 semaines (trois fois par semaine) à trois singes vervet. On a augmenté progressivement les niveaux de dose pour les porter de 20 µg/kg p.c. à 80 µg/kg p.c. pendant la durée de l'expérience. On n'a observé aucune altération statistiquement significative des paramètres cliniques ou hématologiques ou des taux sériques des enzymes chez les animaux traités par rapport aux té-moins, ni aucun changement histopathologique dans le foie ou dans d'autres organes des animaux traités¹⁰⁶. Même s'ils sont préliminaires, ces résultats, semblent indiquer que la NOAEL de la microcystine-LA chez les singes vervet n'est pas inférieure et pourrait même être supérieure à la NOAEL de la microcystine-LR observée chez les souris⁹⁴.

Ueno et al.¹⁰⁷ ont exposé des souris femelles BALB-c à 20 µg de microcystine-LR/L dans l'eau potable pendant sept jours par semaine, ad libitum pendant 18 mois (567 jours). Les souris témoins ont reçu de l'eau seulement. On a sacrifié des animaux à trois, six, 12 et 18 mois. On a calculé à 35,5 µg par souris l'apport cumulatif moyen de microcystine-LR après 18 mois d'exposition. On n'a observé aucune toxicité chronique ou accumulation de toxine dans le foie, ni aucune absorption au niveau des intestins au cours de l'étude. Le traitement n'a eu aucun effet sur la consommation d'eau ou d'aliments et l'on n'a constaté aucun changement re-lié au traitement dans un vaste éventail de paramètres d'essai.

Toxicité pour la reproduction et le développement

Afin d'étudier les effets de la microcystine-LR sur le développement embryonnaire et foetal de la souris, on a administré à quatre groupes de 26 souris femelles de souche Cr1:CD-1(ICR)BR, une fois par jour et par voie orale (gavage), une solution aqueuse de microcystine-LR du 6^e au 15^e jour (inclusivement) de gestation. Les niveaux de dose étaient de 0, 200, 600 et 2 000 µg/kg p.c. par jour. Au 18^e jour de gestation, on a sacrifié les femelles et procédé à une nécropsie. On a pesé les foetus, déterminé leur sexe et les a examinés minutieusement afin de détecter toute anomalie externe, viscérale et squelettique. On a établi un lien entre le trai-tement à 2 000 µg/kg p.c. par jour seulement et une toxi-cité et une mortalité maternelles; sept des 26 femelles sont mortes et l'on en a sacrifié deux prématurément parce qu'elles présentaient des signes de souffrance. On n'a constaté aucun effet manifeste du traitement sur la taille des portées, sur le taux de résorption ou sur la distribution du sexe des foetus vivants à aucun niveau de dose. Le poids moyen des foetus a été sensiblement moins élevé chez les sujets qui ont reçu la dose élevée et le taux de foetus présentant un retard d'ossification sque-lettique a augmenté. Dans les deux cas, ces résultats sont associés couramment à une toxicité maternelle. D'autre part, on n'a pas observé d'augmentation du taux d'anomalies foetales à aucune dose. La dose sans effet pour tout aspect de la toxicité sur le développement a été de 600 µg/kg p.c. par jour^94,95.

Afin d'examiner l'effet d'un extrait toxique de Microcystis aeruginosa sur la reproduction chez les souris, Falconer et al.¹⁰¹ ont exposé des parents mâles et femelles à une solution diluée à un quart de l'extrait (environ 2 800 µg/kg p.c. par jour) administrée dans l'eau de consommation durant les 17 semaines qui ont précé-dé l'accouplement, durant toute la gestation, ainsi qu'au début de la lactation. Les chercheurs n'ont observé au-cun effet sur la fertilité, sur la mortalité embryonnaire ou sur la tératogénicité, sauf une réduction d'environ 10 % de la taille du cerveau chez les nouveau-nés par rapport aux témoins.

Promotion des tumeurs

On a observé des signes de promotion des tumeurs au cours d'études sur des animaux. Au cours d'un bio-dosage de cancérogenèse en deux étapes modifié effec-tué sur la peau de souris, on a appliqué du diméthyl-benzanthracène (DMBA) (500 µg) dans de l'acétone sur la peau de quatre groupes sur six de 20 souris Swiss fe-melles âgées de trois mois. Après une semaine, les sou-ris traitées au DMBA ont reçu 1) de l'eau potable, 2) un extrait de Microcystis dans l'eau potable (dose exacte de microcystine-YM non précisée), 3) de l'huile de croton (groupe témoin positif) appliquée sur la peau (0,5 % dans 0,1 mL d'acétone deux fois par semaine), et de l'eau potable ou 4) de l'huile de croton et un extrait de Microcystis. Les souris témoins ont reçu de l'eau potable ou un extrait de Microcystis dans l'eau potable. Cin-quante-deux jours après le début, des tumeurs et des ul-cères cutanés importants étaient visibles chez les souris traitées au DMBA qui ont reçu un extrait de Microcystis. La formation de tumeurs a été moins importante chez les trois autres groupes de souris traitées au DMBA. Le poids moyen des tumeurs cutanées par souris était beau-coup plus élevé chez les souris traitées au DMBA qui ont reçu l'extrait de Microcystis que chez les souris trai-tées au DMBA qui ont reçu de l'eau. On n'a pas indiqué le nombre réel de tumeurs par souris et le poids des tu-meurs par rapport au poids des animaux. Les auteurs ont conclu que l'extrait de Microcystis reçu dans l'eau potable pouvait agir comme agent promoteur⁹⁶. Le méca-nisme d'action n'est toutefois pas clair, car les micro-cystines ont de la difficulté à pénétrer dans les cellules de l'épiderme¹⁰⁸. Le poids des tumeurs par souris chez les souris traitées au DMBA et qui ont reçu à la fois l'huile de croton et l'extrait d'algues était légèrement inférieur à celui des souris qui ont reçu de l'huile de croton et de l'eau potable. L'auteur n'a pu expliquer ces derniers résultats⁹⁶.

Au cours d'un biodosage en deux étapes portant sur la cancérogénicité, on a initié des groupes de 9 à 15 rats Fischer 344 mâles âgés de sept semaines en leur injectant par voie intrapéritonéale de la diéthylnitrosamine (200 mg/kg p.c.), et en procédant ensuite à une hépatec-tomie partielle à la fin de la troisième semaine. On a évalué la promotion des tumeurs en injectant par voie intrapéritonéale de la microcystine-LR à raison de 1 ou 10 µg/kg p.c., deux fois par semaine à compter de la troisième semaine de l'expérience. Les chercheurs ont observé une promotion des tumeurs, indiquée par une augmentation des foyers hépatiques positifs de glutathion-S-transférase de forme placentaire (GST-P) après huit semaines chez les animaux qui ont reçu de la microcystine-LR à raison de 10 µg/kg p.c.¹⁰⁹. La micro-cystine-LR n'a eu aucun effet lorsqu'on l'a administrée à des rats non initiés. De même, le traitement avec 1 µg/kg p.c. n'a pas produit d'augmentation significative des foyers. Afin de confirmer l'activité de promotion des tumeurs de la microcystine-LR, les mêmes auteurs ont administré de la microcystine-LR à des doses de 10 µg/kg p.c. avant de procéder à une hépatectomie par-tielle et à des doses de 10, 25 ou 50 µg/kg p.c. deux fois par semaine après hépatectomie partielle à des groupes de 14 à 19 rats mâles. Ils ont constaté que l'augmenta-tion des foyers positifs GST-P après injections intrapéri-tonéales répétées de microcystine-LR était liée à la dose. D'après les auteurs, les résultats semblent indiquer que la microcystine est le plus fort agent promoteur de la tumeur que l'on ait trouvé jusqu'à maintenant. Même si l'étude a porté sur des doses intrapéritonéales, les auteurs ont laissé entendre qu'il faut considérer que la promotion des tumeurs par la microcystine est possible chez les êtres humains aussi.

Ito et al.¹¹⁰ ont comparé l'apparition de nodules néo-plastiques hépatiques chez les souris exposées à la mi-crocystine-LR par voie intrapéritonéale et orale sans traitement préalable par des initiateurs. Ils ont observé l'apparition de multiples nodules néoplastiques (jusqu'à 5 mm de diamètre) dans toutes les souris (13/13) qui ont reçu des injections intrapéritonéales de 20 µg de micro-cystine-LR/kg (cinq fois par semaine), ce qui représente un total de 100 injections en 28 semaines. On a sacrifié cinq souris immédiatement après la dernière injection et laissé les huit autres se rétablir pendant deux mois avant de les sacrifier. Le poids du foie chez les sujets de ces deux groupes s'établissait à 9,0 % et 6,8 % du poids cor-porel total, comparativement à 4,7 % chez les témoins. Les mêmes chercheurs ont exposé 22 souris à l'adminis-tration répétée par intubation intragastrique de 80 µg de microcystine-LR/kg pendant 80 ou 100 traitements sur une période de 28 semaines. On a accordé à sept souris une période de sevrage de deux mois avant de les sacri-fier. Même si les hépatocytes de certains des animaux présentaient des lésions, on n'a constaté aucune lésion chronique caractéristique du foie, comme la fibrose et l'apparition de nodules, comme on en a observé au cours de l'étude sur l'administration intrapéritonéale. Le poids moyen du foie des sujets ne présentait pas de différences significatives par rapport à celui des témoins.

Au cours d'une autre étude d'initiation et de promotion de tumeurs visant à évaluer les effets promoteurs de tumeur possible dans la partie supérieure de l'intestin grêle, Falconer et Humpage¹¹¹ ont administré par voie orale deux doses (40 µg/kg p.c. dans chaque cas) de l'initiateur N-méthyl-N-nitrosourée à des souris noires C57, à une semaine d'intervalle, et ensuite de l'eau potable contenant diverses concentrations d'extraits de Microcystis (0, 10 ou 40 mg de toxines de Microcystis par litre) que l'on a jugées équivalentes à 0, 1,2 ou 4,2 mg de microcystine/kg p.c. par jour, pendant une période maximale de 154 jours. On n'a constaté aucune tumeur primitive du foie chez les sujets d'aucun groupe ni aucun signe de promotion, provoqué par la microcys-tine, de tumeurs lymphoïdes ou duodénales.

On a constaté que la microcystine-LR était un inhi-biteur puissant des protéines eucaryotes sérine/thréonine phosphatases 1 et 2A in vitro^112,113 et in vivo¹¹⁴. Cet effet a constitué la base d'un des biodosages réalisés pour en détecter la présence. On considère que ces substances sont des agents promoteurs de tumeur de type 12-O-tétradécanoylphorbol-13-acétate (TPA). Dans le cas de l'agent promoteur de tumeur TPA, on attribue le mécanisme d'action au fait qu'il active la protéine kinase C. L'acide okadaïque, la nodularine, la tautomycine et la calyculine A sont d'autres substances qui agissent comme les microcystines (pour un compte rendu, voir Fujiki et Suganuma⁹²). Les protéines phosphatases jouent un rôle important de régulateur en maintenant l'homéostasie dans la cellule. Elles ralentissent la division cellulaire en contrant les effets de diverses kinases par déphosphorylation des protéines. L'inhibition de la protéine phosphatase entraîne un déplacement de l'équilibre vers une phosphorylation plus élevée des pro-téines cibles. Il s'agit d'une importante modification post-traduction. Elle peut entraîner un signal excessif et une prolifération des cellules, une transformation cellu-laire et la promotion de tumeurs. Dans les cellules hépa-tiques, les composants du cytosquelette (filaments moyens suivis de microfilaments) sont atteints, ce qui peut entraîner une diminution du contact avec les autres cellules^100,115. L'inhibition de la protéine phosphatase 2A par la microcystine-LR peut être inversée de façon effi-cace en présence d'anticorps polyclonaux contre la microcystine-LR¹¹⁶. On ne connaît pas les répercussions d'une exposition chronique à de faibles concentrations de microcystines chez les êtres humains.

Génotoxicité

On n'a observé aucune réponse mutagène dans le cas des toxines purifiées dérivées de Microcystis au cours du test d'Ames sur Salmonella avec ou sans activation S9. Le test de sporulation multigènes sur Bacillus subtilis s'est également avéré négatif en ce qui concerne la mutagénicité pour les souches 168 et hcr-9. En revanche, les résultats d'une étude au cours de laquelle on a testé des toxines purifiées sur des lymphocytes humains indiquent que les toxines peuvent être clastogè-nes, comme l'indique une augmentation des ruptures chromosomiques en fonction de la dose¹¹⁷. Ding et al.¹¹⁸ ont signalé récemment qu'un extrait de cyanobactérie microcystique (tiré de >90 % de Microcystis aeroginosa) a produit une forte réaction mutagène au cours du test d'Ames (souches TA97 TA98, TA100 et TA102, avec ou sans activation S9), a causé d'importants dommages à l'ADN d'hépatocytes de rats soumis à une culture primitive (test des comètes) et produit des érythrocytes polychromatiques micronuclés dans la moelle osseuse de souris.