Les bactéries hétérotrophes

7.0 Méthodes de numération des bactéries hétérotrophes

Les méthodes de numération des bactéries hétérotrophes sont des méthodes simples à base de culture conçues pour récupérer un vaste éventail d'organismes. Bien qu'il n'y ait pas un seul milieu de culture, une seule température ou une seule durée d'incubation qui puisse garantir la récupération de tous les organismes présents dans l'eau, la 20^e édition de Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (APHA et coll., 1998) indique les conditions auxquelles il faut satisfaire pour établir une estimation significative de certaines espèces cultivables.

On utilise actuellement trois méthodes - c.-à-d. milieux coulés en boîte de Pétri, plaques préparées par étalement et filtration sur membrane - pour le dénombrement des bactéries hétérotrophes (APHA et coll., 1998). Selon la méthode utilisée, différents milieux de culture sont disponibles, y compris la gélose pour dénombrement sur plaque, la gélose m-HPC, la gélose R2A, et la gélose NWRI. Tous les milieux sauf la gélose m-HPC peuvent servir avec les méthodes du milieu coulé en boîte de Pétri et de la plaque préparée par étalement. La filtration sur membrane n'utilise toutefois pas de gélose pour dénombrement sur plaque, mais se sert des géloses R2A, NWRI et m-HPC. Il convient de signaler qu'afin d'établir des comparaisons significatives entre les résultats de la numération des bactéries hétérotrophes, il faut utiliser la même méthode et le même milieu, et suivre les mêmes procédures d'incubation.

L'échantillon doit être analysé dans les 8 heures suivant le prélèvement. Toutefois, si on le conserve à une température inférieure à 4 °C mais supérieure au point de congélation, l'analyse dans les 24 heures est jugée acceptable (APHA et coll., 1998).

La numération des bactéries hétérotrophes doit être effectuée conformément aux instructions des autorités compétentes. Dans de nombreux cas, celles-ci recommandent ou exigent le recours à des laboratoires accrédités. Dans certains cas, il peut être nécessaire d'utiliser d'autres moyens, comme les laboratoires non accrédités ou les trousses d'essai, pour analyser les échantillons rapidement. Dans de tels cas, des échantillons de validation doivent être envoyés à des laboratoires accrédités pour une confirmation des résultats. Les conditions de l'échantillonnage de validation doivent être définies par les autorités compétentes.

7.1 Méthode du milieu coulé en boîte de Pétri

La méthode du milieu coulé en boîte de Pétri consiste à ajouter un faible volume d'échantillon (0,1-2,0 ml) à de la gélose fondue (44-46 °C) et à verser le mélange dans des boîtes de Pétri que l'on incube ensuite pendant le temps nécessaire. Comme on le décrit en détail dans Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (APHA et coll., 1998), on utilise en général deux méthodes d'incubation. Il est possible de garder les boîtes de Pétri à 35 °C pendant 48 heures ou à 20-28 °C pendant 5 à 7 jours. La méthode du milieu coulé en boîte de Pétri donne en général des colonies petites et compactes, donc plus faciles à compter. Par ailleurs, comme les colonies sont submergées, il leur faut souvent plus de temps pour se multiplier et elles sont difficiles à transférer (au besoin). En outre, comme on ajoute l'échantillon à la gélose dont la température s'établit entre 44 et 46 °C, cela peut causer un choc thermique aux bactéries.

7.2 Méthode de la plaque préparée par étalement

La méthode de la plaque préparée par étalement offre l'avantage d'utiliser une gélose solidifiée, ce qui élimine la possibilité de choc thermique. L'échantillon est étalé sur la surface de la gélose (0,1-0,5 ml) et l'on incube les plaques de la façon requise (détaillée ci-dessus). Certains milieux donnent de meilleurs résultats dans des conditions particulières (APHA et coll., 1998). Les colonies ainsi obtenues sont faciles à transférer et il est possible d'en distinguer la morphologie. Comme l'échantillon appliqué doit être absorbé dans la surface de la gélose, on ne peut utiliser qu'un échantillon de faible volume.

7.3 Méthode de la filtration sur membrane

Lorsqu'on utilise la méthode de filtration sur membrane, on fait passer un échantillon d'eau par un filtre de 0,45 µm qui garde à sa surface les micro-organismes hétérotrophes. On dépose ensuite le filtre sur un milieu de culture que l'on incube de la façon requise (décrite ci-dessus). Cette méthode élimine aussi la possibilité de choc thermique, mais comme les colonies ne se forment que dans les limites du filtre utilisé, la méthode limite la superficie d'observation. Des pressions de filtration excessives peuvent aussi endommager les cellules. Cette méthode permet toutefois d'analyser des volumes plus importants d'eau de faible turbidité.