Les protozoaires : la Giardia et le Cryptosporidium

7.0 Méthodes d'analyse

7.1 Détection

Les méthodes actuelles de surveillance systématique de la Giardia et du Cryptosporidium sont semi-quantitatives seulement et ne produisent pas de renseignements sur leur viabilité ou sur leur infectiosité pour les êtres humains. La méthode 1623 de l'Environmental Protection Agency (EPA) des États-Unis, par exemple, est une des méthodes les plus utilisées pour la détection simultanée de la présence de Cryptosporidium et de Giardia dans l'eau, mais elle ne détermine pas la viabilité ni l'infectiosité des kystes et des oocystes (EPA des États-Unis 2001). La plupart des échantillons d'eau contiennent peu de kystes ou d'oocystes et il est nécessaire de recourir à des techniques de concentration pour obtenir un nombre même faible de kystes ou d'oocystes. Il n'existe de plus aucune méthode fiable pour cultiver ces deux organismes à partir d'un échantillon d'eau, bien que des procédures de dékystement et de culture existent pour les deux parasites.

L'analyse systématique des parasites protozoaires dans des échantillons d'eau repose sur la détection directe au microscope après concentration de la matière particulaire par filtration ou centrifugation. On peut en général réaliser la concentration des échantillons par filtration à l'aide d'un filtre en bobine de 1 µm de porosité nominale (Jakubowski et Ericksen 1978; APHA 1995), d'un filtre à membrane de 2 µm de porosité absolue (Spaulding et al. 1983; Wallis et Buchanan-Mappin 1984; Ongerth 1989), ou de filtres de polysulfone de 1 µm de porosité absolue (Fricker et Clancy 1998). Dans ce dernier cas, on a signalé des rendements de récupération variant de 70 à 80 %. Trois méthodes de filtration ont été validées pour utilisation avec la méthode 1623, soit le filtre à capsule Envirochek^MD, le filtre à capsule CrypTest^MD et le filtre en mousse Filta-Max^MD (EPA des États-Unis 2001).

Si on utilise un filtre à membrane ou en bobine pour l'eau brute ou l'eau potable traitée, environ 1 000 L sont filtrés et les matières particulaires sont récupérées par lavage en sens inverse, rinçage, lavage à la main ou traitement mécanique (en utilisant un sac adapté au Stomacher) (LeChevallier et al. 1991a,b) et concentrées en culot. Le matériau de base du culot est alors réduit par centrifugation en gradient de densité discontinue à l'aide de sulfate de zinc, d'une solution de saccharose à 1,0 M ou d'un mélange de Percoll (Pharmacia Biotech) et de saccharose. Avec la centrifugation, les particules les plus denses passent à travers le milieu dense et forment un culot au bas du tube. Théoriquement, les kystes de Giardia et les oocystes de Cryptosporidium doivent flotter à la surface du milieu dense, où on peut les récupérer à la pipette. En pratique, l'utilisation de milieux denses engendre des erreurs importantes. Les oocystes morts de Cryptosporidium ont tendance à passer à travers le milieu dense et à s'accumuler dans le culot. Les solutions de saccharose et de sulfate de zinc concentrent de manière sélective les oocystes viables (Bukhari et Smith 1995), tandis que le mélange Percollsaccharose concentre les oocystes vides (fantômes) (LeChevallier et al. 1995). La matière récupérée de la surface du milieu dense est alors concentrée de nouveau par centrifugation et le culot final est examiné au microscope. Les filtres à membrane offrent des rendements de récupération plus élevés, mais la quantité d'eau qui peut passer à travers le filtre sans l'obstruer est faible (souvent seulement 10 à 20 L). Les filtres à membrane sont cependant utiles, car ils retiennent plus de matières et peuvent être dissous afin de récupérer les kystes et les oocystes (Aldom et Chagla 1995).

La séparation immunomagnétique (SIM) ou immunocapture peut remplacer les procédés à flottation par gradient de densité et est de plus en plus utilisée (McCuin et al. 2001; Moss et Arrowood 2001; Rimhamen-Finne et al. 2001, 2002; Sturbaum et al. 2002; Ward et al. 2002). En général, on traite des échantillons de 10 L; la matière récupérée est éluée à l'aide d'un détergent et concentrée par centrifugation. Le culot est remis en suspension dans un tampon, puis mélangé à des anticorps monoclonaux spécifiques associés à des particules magnétisées aussi appelées billes immunomagnétiques. Les kystes et les oocystes sont alors séparés des débris dans un champ magnétique. On peut récupérer avec un rendement >90 % les oocystes ajoutés à des eaux de faible turbidité (Fricker et Clancy 1998). Même si la méthode SIM aide à diminuer le nombre de résultats faussement positifs en réduisant le niveau de débris sur les lames préparées pour analyse microscopique, elle est relativement coûteuse et peu de fabricants fournissent les billes immunomagnétiques (p. ex., Dynal Inc., Aureon Biosystems, ImmuCell Inc., Miltenyi Biotech). On a signalé de plus que des concentrations élevées de fer pouvaient inhiber la séparation immunomagnétique (Yakub et Stadterman-Knauer 2000).

L'utilisation d'anticorps spécifiques pour les kystes de Giardia et les oocystes de Cryptosporidium a fortement augmenté la probabilité de détecter ces organismes dans un milieu encombré et de les identifier de façon formelle. La coloration par immunofluorescence s'effectue généralement en piégeant une portion du culot sur une petite membrane au travers de laquelle on fait passer des anticorps, mais peut également se faire par centrifugation dans des tubes, ou sur des lames porte-objet (Sauch 1985; LeChevallier et al. 1991a,b; Wallis 1994). Malheureusement, la taille et les caractéristiques de coloration de certaines algues sont très semblables à celles des kystes et des oocystes, et il est souvent nécessaire, pour l'identification finale, de recourir à la microscopie à interférence lumineuse, de phase ou différentielle en plus de l'immunofluorescence. On trouve dans le commerce, chez divers fabricants (Meridian Diagnostics Ltd., Cellabs Pty. Ltd., Waterborne Inc.), des anticorps monoclonaux murins qui se présentent dans des trousses de fluorescence directe ou indirecte. L'intercalation de colorant vital DAPI met en évidence le noyau et facilite l'identification (Grimason et al. 1994).

La détection des kystes de Giardia et des oocystes de Cryptosporidium par immunofluorescence nécessite un équipement spécialisé et un niveau élevé de connaissances techniques. L'analyse est fastidieuse, coûteuse et elle est seulement semi-quantitative, mais on l'a utilisée, lors d'un grand nombre d'éclosions, pour confirmer la transmission par l'eau des deux parasites et elle est sans cesse perfectionnée. Clancy et al. (1994) ont mené une étude à l'insu (analyse d'échantillons de filtre artificiellement traités) de 16 laboratoires commerciaux aux États-Unis et ont constaté que la récupération des kystes de Giardia allait de 0,8 à 22,3 % (avec une moyenne de 9,3 %) et que la récupération des oocystes de Cryptosporidium variait entre 1,3 et 5,5 % (avec une moyenne de 2,8 %). En 1995, Santé Canada a commandé une étude similaire dans des laboratoires commerciaux, gouvernementaux et de recherche au Canada, et la récupération des kystes de Giardia a varié entre 0 et 90 % (avec une moyenne de 21 %) pour huit laboratoires ayant analysé 10 échantillons inconnus. La récupération des oocystes de Cryptosporidium a varié entre 0 et 43 % (avec une moyenne de 5,3 %) pour les mêmes échantillons (Clancy Environmental Consultants, Inc. 1996). LeChevallier et al. (1995) ont mené une analyse critique de la méthode d'immunofluorescence et ils ont conclu que les pertes d'oocystes de Cryptosporidium excédaient généralement les pertes de kystes de Giardia et que la plus grande partie des pertes se produisait lors de la centrifugation et de la clarification.

On a proposé d'autres techniques pour détecter la présence de kystes et d'oocystes après concentration et récupération. La cytométrie de flux conjuguée à l'élutriation, par exemple, sert de plus en plus comme technique substitut de séparation et de dénombrement (Vesey et al. 1997; Bennett et al. 1999; Reynolds et al. 1999; Delaunay et al. 2000; Lindquist et al. 2001). La présence d'algues autofluorescentes et la réaction croisée d'autres micro-organismes et particules avec les anticorps monoclonaux inhibe toutefois la spécificité et la sensibilité de l'élutriation. Des travaux réalisés récemment par Ferrari et al. (2000) ont débouché sur la mise au point d'une épreuve d'élutriation bichrome qui a réglé un grand nombre de ces problèmes et a amélioré considérablement la spécificité de la méthode. On a aussi utilisé des dispositifs automatisés de tri cellulaire (p. ex., ChemScan RDI) pour détecter la présence de kystes et d'oocystes et ces dispositifs sont relativement faciles à utiliser (Rushton et al. 2000; De Roubin et al. 2002).

On a aussi utilisé un certain nombre de méthodes moléculaires pour détecter la présence de kystes et d'oocystes de Giardia et de Cryptosporidium. La méthode RCP, surtout conjuguée à la SIM (c.-à-d. SIM-RCP) a été utilisée par de nombreux groupes (Deng et al. 1997, 2000; Bukhari et al. 1998; Di Giovanni et al. 1999; Kostrzynska et al. 1999; Rochelle et al. 1999; Hallier-Soulier et Guillot 2000; Hsu et Huang 2001; McCuin et al. 2001; Moss et Arrowood 2001; Rimhanen-Finne et al. 2001, 2002; Sturbaum et al. 2002; Ward et al. 2002). La réaction RCP est très sensible et spécifique lorsqu'on la conjugue à d'autres techniques de biologie moléculaire, comme celle du polymorphisme de restriction (RFLP) et elle peut servir à distinguer des espèces et des génotypes de Cryptosporidium. On peut utiliser l'information sur le génotype pour aider à déterminer les sources hôtes possibles de Cryptosporidium à l'origine d'une éclosion (Morgan et al. 1997; Widmer 1998; Lowery et al. 2000, 2001a,b). La réaction RCP est très sensible (c.-à-d. au niveau d'un seul kyste ou oocyste), se prête à l'automatisation et peut permettre de distinguer les kystes et oocystes viables de ceux qui ne le sont pas. L'eau contient toutefois souvent plusieurs inhibiteurs de la réaction RCP, y compris des cations divalents et les acides humique et fulvique (Sluter et al. 1997). En dépit de la possibilité d'inhibition de l'amplification, on a mis au point plusieurs épreuves RCP pour détecter la présence de kystes et d'oocystes d'origine hydrique. Certaines de ces épreuves comprennent notamment les amorces visant les régions de codage 18S de l'ARNr (Lowery et al. 2000; Ong et al. 2002; Sturbaum et al. 2002; Ward et al. 2002) ou le codage de l'ARNm pour les protéines de choc thermique (c.-à-d. épreuve de la transcriptase inverse-RCP ou TI-RCP) (Stinear et al. 1996; Kaucner et Stinear 1998; Griffin et al. 1999; Gobet et Toze 2001; Karasudani et al. 2001). On a aussi utilisé la méthode d'hybridation in situ par fluorescence (FISH) pour détecter la présence de kystes et d'oocystes de Giardia et de Cryptosporidium. À cause des signaux relativement faibles, l'interprétation microscopique a toutefois posé des difficultés, d'où l'utilisation limitée de cette méthode (Deere et al. 1998; Vesey et al. 1998; Dorsch et Veal 2001).

7.2 Viabilité et infectiosité

Comme on l'a mentionné ci-haut, les méthodes de détection systématique ne fournissent pas d'indications sur la viabilité ou l'infectiosité des kystes et oocystes. On peut estimer la viabilité par dékystement (mais pas l'infectiosité). Il est possible de dékyster la Giardia en utilisant de l'acide et des enzymes tels que la trypsine, puis de la cultiver dans un milieu TYI-S-33 (Diamond et al. 1978; Rice et Schaefer 1981), mais le taux de dékystement pour la G. duodenalis est souvent faible. Il est aussi possible de dékyster des oocystes de Cryptosporidium parvum pour mesurer la viabilité (Black et al. 1996). On a toutefois démontré que les méthodes de dékystement étaient des indicateurs relativement médiocres de la viabilité des oocystes de Cryptosporidium. Neumann et al. (2000b) ont observé que des oocystes non dékystés qui se sont rétablis après des méthodes de dékystement d'usage courant demeuraient infectieux pour les souris nouveau-nées.

Il est aussi possible de déterminer la viabilité des oocystes au moyen d'épreuves d'infectiosité pour la souris. Les deux parasites peuvent être utilisés pour infecter des animaux de laboratoire tels que la gerbille (pour la Giardia) (Belosevic et al. 1983) ou les souris CD-1 nouveau-nées (pour Cryptosporidium) (Finch et al. 1993b) et cette technique est utile pour les études réalisées en usine-pilote ou pour le prélèvement d'isolats; toutefois, la plupart des laboratoires de chimie analytique n'ont pas de colonies d'animaux et les coûts sont élevés. La culture et l'infection d'animaux sont donc plus utiles pour la recherche (p. ex. l'étude de l'efficacité de la désinfection) que pour la surveillance systématique (Delaunay et al. 2000; Korich et al. 2000; Matsue et al. 2001; Noordeen et al. 2002; Okhysen et al. 2002; Rochelle et al. 2002).

Plusieurs méthodes de coloration ont été mises au point pour l'évaluation de la viabilité des kystes et des oocystes (Robertson et al. 1998; Freire-Santos et al. 2000; Neumann et al. 2000b; Gold et al. 2001; Iturriaga et al. 2001). Celles qui ont suscité le plus d'attention sont les méthodes utilisant les colorants fluorogéniques DAPI et l'iodure de propidium (PI), ainsi que les colorants d'acides nucléiques. En général, DAPI et PI offrent une bonne corrélation avec le dékystement in vitro (Campbell et al. 1992). On peut répartir en trois classes les kystes et les oocystes : (1) viables (perméables au DAPI, imperméables au PI), (2) non viables (perméables au DAPI et au PI) et (3) quiescents ou dormants (imperméables au DAPI et au PI, mais pouvant être viables). Neumann et al. (2000a) ont démontré l'existence d'un lien solide entre l'intensité de la coloration par SYTO-9® et SYTO-59® et l'infectiosité pour les animaux d'oocystes de C. parvum fraîchement isolés. Les colorants d'acide nucléique se sont aussi révélés utiles pour déterminer la viabilité et l'infectiosité des kystes et des oocystes dans des échantillons environnementaux. On a utilisé avec succès des colorants comme le SYTO-59 conjugué à des anticorps marqués par FITC pour déterminer la viabilité et l'infectiosité de kystes et d'oocystes dans des échantillons d'eau, parce que leurs spectres fluorescents ne chevauchent pas celui de FITC (Belosevic et al. 1997; Bukhari et al. 2000; Neumann et al. 2000b). La perméabilité du colorant et les méthodes de dékystement surestiment toutefois la viabilité et l'infectiosité possible des oocystes traités ou désinfectés (Jenkins et al. 1997).

Des progrès récents ont facilité l'utilisation des essais de culture de tissus in vitro pour estimer l'infectiosité des oocystes dans l'eau (Di Giovanni et al. 1999; Hijjawi et al. 2001; Weir et al. 2001; Rochelle et al. 2002). Les échantillons d'eau concentrés sont désinfectés et habituellement inoculés dans des monocouches cellulaires d'adénocarcinomes iléocaecaux humains (HCT-8). Après une incubation de 24 à 48 heures, on examine la monocouche pour vérifier la présence de phases de reproduction spécifiques au moyen d'un essai antigèneanticorps indirect (Slifko et al. 1997) ou d'un essai transcriptase inverse- réaction en chaîne de la polymérase (TI-RCP) (Rochelle et al. 1997). Lors d'une expérience de comparaison, les pourcentages moyens de viabilité des oocystes de C. parvum âgés de moins de deux mois ont été respectivement de 42, 40 et 78 % pour l'infectiosité des cultures de tissus, le dékystement et les essais DAPI/PI (Slifko 1998). L'épreuve de culture cellulaire offre plusieurs avantages, y compris une grande sensibilité (c.-à-d. un seul oocyste), son applicabilité à l'analyse d'échantillons d'eau brute et traitée, sa facilité d'exécution et la production rapide de résultats. L'inconvénient de cette méthode, c'est qu'elle oblige à maintenir une lignée cellulaire et est souvent peu reproductible entre des échantillons semblables pour procéder à des évaluations quantitatives. On a également appliqué la TI-RCP à la détection directe de la Giardia et du C. parvum viables dans des concentrés d'eau (Kaucner et Stinear 1998). Lorsqu'on la compare à la méthode DAPI/PI par immunofluorescence, la fréquence de détection de la Giardia viable passe de 24 % avec l'IFA à 69 % avec la TI-RCP. Quant au C. parvum viable, on ne l'a détecté que dans 3 % des échantillons avec la TI-RCP alors qu'il l'a été dans 14 % avec l'IFA DAPI/PI, ce qui laisse supposer que d'autres espèces de Cryptosporidium se trouvaient dans les échantillons. La méthode TI-RCP présente quelques inconvénients, y compris le besoin de petits volumes traités, l'inhibition possible par des constituants environnementaux, l'inefficacité de l'extraction de l'ARN des kystes et des oocystes, et sa nature non quantitative.

On a proposé d'autres essais de viabilité, tels que l'hybridation in situ par fluorescence (FISH) et les sondes d'acide nucléique pour détecter l'ARN ribosomique 18S dans la Giardia et le Cryptosporidium (Fricker et Clancy 1998). La molécule 18S est abondante dans les kystes et oocystes viables, mais sa présence baisse rapidement dans les kystes et oocystes non viables. Son incapacité d'évaluer l'infectiosité des kystes et des oocystes limite l'utilité de cette méthode. Des études supplémentaires sont nécessaires pour améliorer la limite de détection et pour valider les essais.