Renseignements sur les aliments nouveaux - Lignée de soja MON87708 tolérant au dicamba

Santé Canada a avisé Monsanto Canada Inc. qu'il ne s'oppose pas à la vente d'aliments dérivés du soja MON87708 tolérant au dicamba. Le Ministère a réalisé une évaluation approfondie de cette lignée de soja, conformément aux Lignes directrices sur l'évaluation de l'innocuité des aliments nouveaux. Ces lignes directrices sont fondées sur des principes admis internationalement pour l'établissement de l'innocuité des aliments à caractères nouveaux.

Contexte

Le texte qui suit résume l'avis que Monsanto Canada Inc. a fourni à Santé Canada ainsi que l'évaluation de Santé Canada; il ne contient aucun renseignement commercial confidentiel.

1. Introduction

Monsanto Canada a mis au point la lignée de soja MON87708 tolérant au dicamba en modifiant une variété commerciale de soja (A3525) et en faisant appel à la technologie de l'ADN recombinant pour l'introduction de la séquence codante dicamba mono-oxygénase (dmo) dérivée de la bactérie Stenotrophomonas maltophilia. La séquence code pour la protéine DMO, laquelle catalyse la déméthylation de l'herbicide dicamba en composés non herbicides que sont l'acide 3,6-dichlorosalicylique et le formaldéhyde.

L'évaluation de l'innocuité menée par les évaluateurs de la Direction des aliments a été réalisée conformément aux Lignes directrices sur l'évaluation de l'innocuité des aliments nouveaux de Santé Canada. Ces lignes directrices sont fondées sur les travaux d'autres autorités réglementaires et harmonisées avec d'autres documents d'orientation internationaux dans ce domaine (p. ex., avec le Codex Alimentarius). L'évaluation a pris en compte les éléments suivants : la façon dont la lignée de soja MON87708 tolérant au dicamba a été mise au point, la comparaison de sa composition et de sa qualité nutritionnelle par rapport à celles des variétés non modifiées et la toxicité ou l'allergénicité potentielles du soja MON 87708. Monsanto a fourni des données appuyant l'innocuité de l'utilisation à titre d'aliment au Canada de la lignée de soja MON87708 tolérant au dicamba.

La responsabilité des évaluations préalables à la mise en marché des aliments nouveaux et des ingrédients alimentaires nouveaux imposée par la loi incombe à la Direction des aliments, comme établi au titre 28 du Règlement sur les aliments et drogues (Aliments nouveaux). Les aliments dérivés de la lignée de soja MON87708 tolérant au dicamba sont considérés comme des aliments nouveaux selon la partie suivante de la définition de l'expression aliments nouveaux

« c) aliment dérivé d'un végétal, d'un animal ou d'un micro-organisme qui, ayant été modifié génétiquement, selon le cas :

1. présente des caractères qui n'avaient pas été observés auparavant, [...]. »

2. Mise au point du végétal modifié

Le requérant a fourni les renseignements décrivant les méthodes utilisées pour mettre au point la lignée de soja MON87708 tolérant au dicamba ainsi que les données en matière de biologie moléculaire qui caractérisent le changement génétique conférant à la lignée sa tolérance à l'herbicide dicamba. La lignée MON87708 a été produite en recourant à la transformation fondée sur Agrobacterium de la variété commerciale de soja A3525 au moyen du vecteur de transformation PV-GMHT4355.

Le vecteur de transformation PV-GMHT4355 a été élaboré de façon à contenir deux cassettes d'ADN-T (ADN-T I et ADN-T II). La cassette d'ADN-T I contenait le gène d'intérêt, le dmo, et les séquences régulatrices afférentes. L'intégration de cette cassette dans le génome de l'hôte confère la tolérance recherchée aux herbicides dicamba. La cassette d'ADN-T II contenait le gène cp4 epsps et ses séquences régulatrices afférentes. L'intégration de cette cassette dans le génome de l'hôte confère la tolérance recherchée à l'herbicide glyphosate. Cette cassette a été utilisée par le requérant comme agent de sélection spécifique pour les cellules transformées.

Le méristème de la variété de soja A3525 non transgénique a été transformé en recourant au vecteur PV-GMHT4355 transféré par Agrobacterium tumefaciens. Après la coculture avec la bactérie Acrobacterium portant le vecteur, les méristèmes ont été placés dans le milieu de sélection contenant du glyphosate, de la carbenicilline, de la céfotaxime et un mélange de ticarcilline et d'acide clavulanate dans le but d'inhiber la prolifération des cellules végétales non transformées et la croissance excessive d'Agrobacterium. Les méristèmes ont ensuite été placés dans un milieu favorable au développement de pousses et de racines. Les plantes enracinées dotées de caractéristiques phénotypiques normales ont été sélectionnées et transférées dans le sol pour leur culture (R0).

Les plantes R0 produites par cette transformation ont été autopollinisées afin de produire les plantes R1. Une dose de glyphosate non mortelle a été appliquée aux plantes R1, et ces plantes ayant subi une atteinte mineure par l'herbicide ont été sélectionnées pour être soumises à d'autres analyses alors que les plantes indemnes, indiquant qu'elles contenaient la séquence codante cp4 epsps pour l'ADN-T II, ont été écartées à des fins de poursuite de leur développement. Par la suite, les plantes homozygotes pour l'ADN-T 1 ont été identifiées au moyen d'essais quantitatifs utilisant la réaction en chaîne de la polymérase (qPCR). Le résultat de ce processus fut la sélection de MON87708 comme lignée principale pour la poursuite de la caractérisation. Cette lignée ne contient que les éléments génétiques introduits de l'ADN-T I puisque tout élément issu de l'ADN-T II aurait été éliminé au moyen de la multiplication sélective.

L'ADN-T transféré contient le promoteur de produit de transcription de pleine longueur du caulimovirus des stries chlorotiques de l'arachide (PC1SV), la région 5' non codante du virus de la rainure du tabac, le pepside de transit et les 24 premiers acides aminés pour la protéine mature du gène RbcS de Pisum sativum (RbcS), la séquence codante du gène de dicamba mono-oxygénase (dmo) et la région de terminateur du gène RbcS2 de Pisum sativum (pois) (E9).

Le gène dmo est dérivé de la souche DI-6 de la bactérie Stenotrophomonas maltophilia isolée du sol dans une usine de fabrication de dicamba. S. maltophilia est une bactérie aérobie gram négatif ubiquiste sur le plan environnemental et fréquemment présente dans les milieux aquatiques ainsi que dans le sol et les plantes. S. maltophilia est aussi répandue dans le milieu végétal et a été isolée de la rhizosphère du blé, du maïs, des herbes, de la betterave, du concombre, de la chicorée, de la pomme de terre, de la fraise, de la canne à sucre et du colza, de même que de la graine de coton, des gousses de haricot et du café. S. maltophilia est aussi répandue en milieu domestique et peut être détectée près des lave-vaisselle, des éponges, des brosses à dents, des fleurs, des plantes, des fruits, des légumes, du poisson congelé, du lait et de la volaille. Des souches de S. maltophilia ont été détectées dans la flore transitoire des patients hospitalisés à titre de commensal. S. maltophilia est présente chez les personnes en bonne santé sans leur causer de tort et, chez les humains, les infections provoquées par cette bactérie sont rares.

Chez S. maltophilia, la dégradation de dicamba est provoquée par un système enzymatique qui tient lieu de système de transport des électrons auquel contribue une réductase, une ferrédoxine et du composant terminal du dmo. Le composant de ferrédoxine de ce système s'apparente étroitement à la ferrédoxine naturellement présente dans les chloroplastes des plants. Pour profiter de cette source d'origine naturelle de ferrédoxine réduite (et éliminer le besoin d'introduire des composants bactériens de ferrédoxine et de réductase), le requérant a inclus un peptide de transit de chloroplaste dans le but de permettre le transport de la protéine DMO jusqu'à celui-ci.

3. Caractérisation du végétal modifié

L'analyse par transfert de Southern de la lignée de soja MON87708 tolérant au dicamba a révélé l'insertion d'une seule copie de la cassette de l'ADN-T 1 dans le génome du soja, et cela, en un seul locus. L'analyse a aussi porté sur l'absence de toute séquence externe apparentée au squelette plasmidique PV-GMHT4355. On a aussi eu recours à l'analyse par transfert de Southern afin de démontrer l'absence attendue de tout matériel génétique issu d'ADN-T II dans la lignée de soja MON87708 tolérant au dicamba.

Le requérant a réalisé une analyse plus poussée de l'insertion au moyen de la réaction en chaîne de la polymérase (PCR) et du séquençage. En utilisant des amorces de PCR, deux produits de PCR chevauchante comprenant la cassette insérée et l'ADN génomique flanquant, les produits de PCR ont été séquencés afin de confirmer qu'aucune atteinte à une quelconque séquence de la cassette insérée n'est survenue. Selon le séquençage, l'ADN-T I intégré dans le génome de soja correspond à la séquence contenue dans le plasmide et mesure 3 003 pb.

La stabilité générationnelle du seul insert a été déterminée à l'échelle de cinq générations de soja MON87708 tolérant au dicamba. Chaque génération a fait l'objet d'une analyse par transfert de Sourthern afin de confirmer la présence d'ADN-T I.

Le requérant a aussi fourni les résultats de l'analyse de ségrégation de trois générations afin d'indiquer que ce caractère est d'hérédité mendélienne tel qu'on s'y attendait. Les données fournies n'ont indiqué aucune différence sur le plan des rapports attendus, et par conséquent, on considère que la ségrégation survient de la façon prévue. Cela soutient le fait que l'insert se révèle stable dans le génome du soja et qu'il relève, comme on s'y attendait, d'un mécanisme mendélien.

Dans la lignée de soja MON87708, les protéines DMO sont actives dans le chloroplaste, un organite plastidique, où elles peuvent interagir avec la ferrédoxine essentielle à leur fonction. La lignée de soja MON87708 contient une cassette d'expression de dmo qui code pour une seule protéine DMO précurseur ciblant les chloroplastes de la plante. La protéine DMO précurseur contient 84 acides aminés à la partie N-terminale de la protéine, lesquels ont été ajoutés afin que la protéine cible le chloroplaste. Ces acides aminés additionnels correspondent à un peptide de transition du chloroplaste de 57 acides aminés issu d'une petite sous-unité de carboxydismutasedu pois et aux 24 premiers acides aminés de la partie N-terminale de la petite sous-unité mature de carboxydismutase, lesquels sont incorporés afin d'améliorer l'orientation de la protéine précurseur vers le chloroplaste et trois acides aminés codés par une séquence interposée ont été utilisés aux fins de clonage. En règle générale, les peptides de transition sont précisément retirés de la protéine précurseur après le dépôt ciblé du plastide dont découle la protéine de pleine longueur.

L'analyse d'extraits de graine mature de la lignée MON87708 par transfert de Western a révélé la présence de deux bandes immunoréactives. La caractérisation de ces deux bandes a indiqué que la protéine précurseur a été transformée en deux formes de protéines. La bande de plus faible poids moléculaire correspond à la protéine de pleine longueur découlant du retrait du peptide de transition du chloroplaste, des 24 acides aminés de la petite sous-unité de carboxydismutaseet des acides aminés de la séquence interposée (MON87708 DMO). La bande du second poids moléculaire le plus élevé correspond à la protéine DMO plus 27 acides aminés sur la partie N-terminale de la petite sous-unité de carboxydismutasedu pois et de la séquence interposée qui n'ont pas été séparés (MON87708 DMO+27). Le requérant a donné des exemples issus de la documentation de formes autrement transformées d'une protéine ciblant le chloroplaste d'une plante dans lesquels le peptide de transition demeurait.

Le requérant a fourni la caractérisation complète tant de la lignée MON87708 DMO que de la lignée MON87708 DMO+27 en recourant à : 1) l'épreuve immunoblot afin d'établir l'identité et l'immunoréactivité de la protéine MON87708 DMO et de la protéine MON87708 DMO+27 en utilisant un anticorps anti-DMO; 2) l'analyse de la séquence N-terminale de la protéine MON87708 DMO de la protéine MON87708 DMO+27; 3) la spectrométrie de masse à temps de vol pour la désorption-ionisation par impact laser assistée par matrice (MALDI-TOF MS) afin de produire une carte massique de peptides tryptiques des protéines MON87708 DMO et MON87708 DMO+27; 4) l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de SDS (SDS-PAGE) afin d'établir le poids moléculaire apparent des protéines MON87708 DMO et MON87708 DMO+27; 5) l'état de glycosylation des protéines MON87708 DMO et MON87708 DMO+27 et 6) l'analyse de l'activité de la protéine MON87708 DMO afin de démontrer l'activité fonctionnelle. Les résultats de ces analyses ont confirmé l'identité et l'activité fonctionnelle des deux formes de la protéine DMO ainsi que le fait que, dans la lignée de soja MON87708, les protéines ne sont pas glycosylées.

De plus, le requérant a fourni une analyse complète de la spécificité de la DMO (protéines MON87708 DMO et MON87708 DMO+27 isolées de la lignée de soja MON87708). Le requérant a mis à l'épreuve la spécificité des protéines lorsqu'elles sont incubées avec de l'acide o-anisique, le composé endogène le plus étroitement semblable au dicamba sur le plan structurel. Selon ces études, la DMO n'a pas agi sur l'acide o-anisique. De plus, dans le cadre des études menées sur la DMO sauvage, la spécificité des protéines avec l'acide o-anisique a été analysée ainsi qu'une variété d'autres composés semblables au dicamba à divers degrés. Aucun métabolisme des substrats n'a été observé, ce qui confirme la spécificité de la DMO.

L'évaluation de l'innocuité des cultures dérivées au moyen de la biotechnologie comprend la caractérisation des propriétés fonctionnelles et physicochimiques et la confirmation de l'innocuité de la protéine introduite. La protéine MON87708 DMO (tant MON87708 DMO que MON87708 DMO+27) a été purifiée en quantités suffisantes directement à partir de la graine de soja MON87708, puis utilisée pour l'évaluation de l'innocuité. En règle générale, les évaluations de l'innocuité des protéines portent sur des protéines produites en systèmes d'expression hétérologue, par exemple E. coli. Puisque la protéine MON87708 DMO utilisée dans l'évaluation de l'innocuité a été purifiée directement à partir de MON87708, les évaluations de l'équivalence entre la protéine MON87708 DMO produite par la plante et d'origine bactérienne se sont révélées superflues.

4. Renseignements sur le produit

L'insertion du gène nouveau dmo et des éléments régulateurs connexes distingue le soja MON87708 tolérant au dicamba des sojas traditionnels. L'insertion de ce gène entraîne l'expression de protéines nouvelles, MON87708 DMO et MON87708 DMO+27. L'expression de ces protéines confère la tolérance aux herbicides dicamba.

Le requérant a fourni les données démontrant le taux d'expression de la protéine MON87708 DMO (en incluant toujours MON87708 DMO, MON87708 DMO+27 et toutes les formes trimériques) dans le soja modifié. L'étude a porté sur cinq plantes de cinq champs plantés au cours de la saison de croissance 2008 dans certaines des principales régions de production de soja aux États-Unis. Chaque site a été planté en trois parcelles répétées en s'appuyant sur un plan en blocs aléatoires complets. Les données sont présentées à titre de points de données moyens issus de tous les sites dans les feuilles saisonnières à quatre stades (FSL1, FSL2, FSL3 et FSL4), dans les graines, les racines et le fourrage.

Les quantités de la protéine MON87708 DMO ont été déterminées au moyen d'une analyse immuno-enzymatique ELISA validée. Les quantités de protéines présentes dans les tissus ont été calculées sur la base de microgrammes (µg) par gramme (g) de poids frais (pf). La teneur en humidité de tous les types de tissus a été mesurée et les quantités de protéines contenues dans ceux-ci ont été converties en valeurs du poids sec (ps). Les quantités moyennes de protéines MON87708 DMO de tous les sites dans le tissu des feuilles saisonnières FS1, FS2, FS3 et FS4 et dans le tissu des graines, des racines et du fourrage se sont révélées de 17, de 31, de 44, de 69, de 47, de 6,1 et de 53 µg/g ps, respectivement. Selon les données recueillies dans le cadre de cette étude, le requérant a calculé que la protéine MON87708 DMO compte pour environ 0,011 % des protéines totales dans le grain MON87708 sur la base du poids sec.

5. Exposition alimentaire

On s'attend à ce que le soja MON87708 tolérant au dicamba soit utilisé à des fins semblables à celles des autres variétés de soja. À travers le monde, le soja est la source la plus importante d'huile végétale. Le soja raffiné, blanchi et désodorisé peut être transformé davantage afin de produire des huiles à cuisson, du shortening, de la margarine, de la mayonnaise, des sauces à salade et une grande variété de produits soit entièrement à base de matières grasses et d'huiles, soit qui en contiennent comme principaux ingrédients. L'isolat de protéines de soja est utilisé dans des soupes, des bases de sauce, des barres énergisantes, des boissons nutritives, des préparations pour nourrissons et des substituts de produits laitiers.

Aux fins du calcul du degré d'exposition, le requérant a eu recours à la concentration moyenne de MON87708 DMO observée dans le grain, soit 43 µg/g pf. On a souligné qu'en moyenne, au cours de la transformation, la teneur en protéines de soja des produits est multipliée par 1,35 fois. Par conséquent, afin de veiller à ce que l'estimation soit aussi prudente que possible, le requérant a établi la concentration moyenne à 58 µg/g pf, soit la concentration moyenne observée au cours des essais d'expression de la protéine, multipliée par 1,35.

Selon cette hypothèse au 95e centile de la consommation, l'apport alimentaire quotidien serait estimé à 0,0056 et à 0,2314 mg/kg pc/jour pour les adultes et les nourrissons non allaités respectivement. Le requérant a aussi fourni le calcul de la marge d'exposition (ME), laquelle est fondée sur l'exposition estimée et sur la DSEO aiguë déterminée au moyen des essais toxicologiques. Ce calcul détermine le facteur par lequel la quantité de protéines consommées devrait être multipliée pour atteindre la DSEO. La ME calculée pour le soja MON87708 chez les adultes et les enfants non allaités est établie à 24 800 x et à 600 x, respectivement.

6. Nutrition

Les données nutritionnelles relatives à cette demande ont été obtenues à partir du soja expérimental (MON87708), du soja témoin (A3525) et de variétés commerciales de soja (variétés de référence) cultivées en 2008 en cinq endroits des États-Unis dans un plan en blocs aléatoires complets comportant trois parcelles de chaque variété, soit la variété expérimentale, la variété témoin et les variétés commerciales (variétés de référence). Le soja MON87708 a été traité à l'insecticide dicamba à son stade de croissance idéal, et cela, conformément à la quantité maximale autorisée. Les données issues de l'analyse des variétés de référence de tous les sites ont été combinées et utilisées afin d'établir un intervalle de tolérance de 99 % pour chaque composant du soja commercial.

Toutes les expériences d'essai en champ de la lignée de soja tolérant aux herbicides se sont révélées acceptables. Toutes les analyses auxquelles ont été soumises les variétés, soit expérimentale, témoin et de référence, ont été effectuées en recourant à des méthodes scientifiques approuvées et à des méthodes statistiques appropriées.

Les échantillons de graines ont fait l'objet d'une analyse grossière (humidité, protéines brutes, lipides bruts, fibres brutes, cendre, glucides [calculés]) et d'une analyse de la composition en fibres (fibre au détergent acide et fibre au détergent neutre), en acides gras (C8 à C22), en acides aminés (asparagine, thréonine, sérine, acide glutamique, proline, glycine, alanine, cystéine, valine, méthionine, isoleucine, leucine, tyrosine, phénylalanine, histidine, lysine, arginine et tryptophane), en vitamines (vitamine E) ainsi qu'en antinutriments (lectine, acide phytique, raffinose, stachyose, inhibiteurs de la trypsine et isoflavones [daidzéine, génistéine, glycitéine]). Le fourrage a aussi fait l'objet d'une analyse grossière (humidité, protéines brutes, lipides bruts, fibres brutes, cendre, glucides [calculés]) et d'une analyse de la composition en fibres (fibre au détergent acide et fibre au détergent neutre).

Sur le plan des endroits combinés, des différences statistiques ont été observées entre le soja expérimental (MON87708) et le soja témoin (A3525) dans 29 analytes. Relativement aux nutriments et aux facteurs antinutritionnels entre lesquels une différence statistique a été repérée, toutes les valeurs moyennes se situaient dans l'intervalle de tolérance de 99 % ou dans les fourchettes signalées dans la documentation.

7. Toxicologie

Dans une étude de toxicité aiguë par voie orale comportant une période d'observation de 14 jours chez des souris, les préparations de protéine DMO n'ont pas entraîné d'effets indésirables à la dose la plus élevée mise à l'essai de 150 mg/kg pc (DSEO). L'apport quotidien estimé fourni par le requérant (0,23 mg/kg pc/jour) et l'apport quotidien estimé calculé par le PTAS (0,63 mg/kg pc/jour) en protéines DMO dérivées du soja MON87708 chez la sous-population la plus sensible, les nourrissons alimentés au moyen de préparations à base de soja, étaient de deux fois inférieurs à la DSEO. Par conséquent, la consommation chez la sous-population la plus sensible se révèle bien en deçà de la posologie orale aiguë établie au moyen des études chez les mammifères.

Les protéines DMO sont thermolabiles et rapidement digérées dans les fluides gastriques et intestinaux simulés. Par conséquent, il est peu probable que ces protéines seront absorbées comme enzymes actives ou intactes dans le gros intestin.

La protéine DMO compte pour seulement 0,011 % de la teneur totale en protéines des graines de soja MON87708. Aucune homologie d'importance n'a été observée entre la séquence DMO+27 (comprenant la séquence DMO) et des allergènes, des gliadines, des toxines ou une quelconque protéine dont l'innocuité est mise en doute. Par conséquent, il est peu probable que les protéines DMO agiront, une fois consommées, à titre d'allergènes, de facteurs antinutritionnels ou de toxines. Les analyses effectuées avec l'IgE humain indiquent que la modification génétique apportée au soja MON 87708 n'a pas augmenté la concentration en allergènes endogènes si on la compare à celle du soja traditionnel. Qui plus est, les données issues de l'analyse de la composition du soja MON87708 n'ont pas indiqué de concentrations accrues en allergènes ou en toxines endogènes lorsqu'on les compare avec celles du soja traditionnel. Considérés ensemble, ces résultats permettent de présumer que les modifications génétiques ayant donné lieu au soja MON87708 n'ont pas augmenté sa teneur en toxines, en facteurs antinutritionnels ni en allergènes endogènes normalement présents dans le soja.

On s'attend à ce que la teneur en acide 3,6-dichlorosalicylique et en formaldéhyde, lesquels sont issus du métabolisme de l'herbicide dicamba médié par la DMO, ne dépasse pas les limites réglementaires établies en ce qui a trait à l'acide 3,6-dichlorosalicylique et que dans le cas des concentrations en formaldéhyde, elles se situent dans la fourchette des teneurs mesurées dans un éventail de denrées agricoles. Par conséquent, on estime que ni l'un ni l'autre de ces métabolites ne devraient susciter de préoccupations pour la santé.

Conclusion

L'examen qu'a réalisé Santé Canada de l'information présentée à l'appui de la consommation alimentaire du soja MON87708 tolérant au dicamba a permis de conclure que les produits alimentaires dérivés de celui-ci ne suscitent pas de préoccupations sur le plan de l'innocuité. Santé Canada est d'avis que le soja MON87708 tolérant au dicamba est semblable au soja traditionnel ordinaire quant à son caractère acceptable à titre de source alimentaire.

L'opinion exprimée par Santé Canada ne porte que sur l'utilisation du soja MON87708 tolérant au dicamba aux fins de consommation par les humains. Les questions relatives à la sécurité environnementale et à son utilisation comme aliment du bétail ont été examinées distinctement au moyen des processus réglementaires en vigueur au sein de l'Agence canadienne d'inspection des aliments.

Le présent document sur les aliments nouveaux résume l'avis sur le produit visé par la Direction des aliments, Direction générale des produits de santé et des aliments, Santé Canada. Cet avis est fondé sur l'analyse détaillée des renseignements fournis par le requérant, conformément aux Lignes directrices relatives à l'évaluation de l'innocuité des aliments nouveaux.

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