Détermination colorimétrique des nitrates et des nitrites dans les aliments

Méthode de laboratoire
LPFC-126
Décembre 1983

Bureau d'innocuité des produits chimiques
Ottawa

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Définition : La présente méthode s'applique à la détermination des nitrates et des nitrites dans les aliments conformément au tableau XI du titre 16 du Règlement sur les aliments et drogues.

Portée : La méthode a été mise à l'essai, dans un laboratoire, avec des échantillons de produits de viande, de fromages et de six légumes différents (1), et on a obtenu des taux moyens de récupération de 95 % pour le nitrite de sodium ajouté en des concentrations de 10 à 30 ppm, et de 94 % pour le nitrate de sodium ajouté en des concentrations variant de 30 à 400 ppm. Les résultats d'une série subséquente d'essais effectués sur des viandes salées ou fumées révèlent des taux de récupération de nitrite de sodium variant de 80 à 114 % (taux moyen de 95,4 %) (2).

L'ANALYSTE DEVRAIT SE FAMILISARISER AVEC LA MÉTHODE EN UTILISANT DES ÉTALONS ET DES ÉCHANTILLONS DOPÉS AVANT D'ENTREPRENDRE L'ANALYSE D'ÉCHANTILLONS INCONNUS.

Principe : L'échantillon est extrait avec de l'eau distillée et l'extrait aqueux est clarifié avec de l'hydroxyde de zinc. La réduction du nitrate en nitrite s'effectue sur une colonne de cadmium poreux (le nitrite présent au départ ne subit pas d'altération); l'acide sulfanilique est diazoté par le nitrite et, par copulation avec du chlorhydrate de N (naphtyl-1)-éthylènediamine, forme un colorant azoïque rose dont la densité optique est déterminée à 550 nm. Pour les échantillons contenant à la fois des nitrites et des nitrates, on procède tout d'abord à la détermination de la teneur en nitrites à partir du filtrat de l'échantillon non réduit, puis à celle de la teneur totale en nitrites (nitrites existants plus nitrites formés à partir des nitrates) dans l'éluat de la colonne. La teneur en nitrates est ensuite calculée par différence.

Mise en garde : Tous les produits chimiques doivent être manipulés avec soin. Pour plus de renseignements sur les autres dangers de nature chimique, se reporter aux mises en garde décrites au chapitre 51 (sécurité en laboratoire) de l'édition actuelle des Méthodes officielles d'analyse, Association des chimistes analystes officiels, Washington, D.C., ou à tout autre document reconnu traitant de la sécurité en laboratoire.

Matériel :

1. Mélangeur Waring, ou l'équivalent.
2. Colonne de cadmium, réducteur de Jones modifié.

3. Spectrophotomètre Spectronic 20 de Baush and Lomb, ou l'équivalent.

Mise en garde :

1. Utiliser de l'eau distillée tout au long de l'expérience.

2. Rincer soigneusement toute la verrerie de laboratoire avec de l'eau distillée.

Réactifs :

1. Solution-tampon d'ammoniac, pH de 9,6 à 9,7.
a) diluer 20 mL de HCl concentré avec de l'eau jusqu'à l'obtention d'une quantité de 500 mL;

2. Solution de sulfate de zinc, 0,42 M.

3. Solution aqueuse d'hydroxyde de sodium à 2 % (p/v).
4. Solution de sulfate de cadmium, 0,14 M.

5. Bâtonnets de zinc métallique (d'environ 10 cm).

6. Acide sulfanilique

7. Solution d'acide sulfanilique à 1 % dans de l'acide acétique à 30 %.

8. Chlorhydrate de N(naphtyl-1)-éthylènediamine (réactif de Marshall) à 0,1 % dans de l'acide acétique à 60 %.

9. réactif de coloration.

10. Solutions-étalons de nitrate de sodium :
I. Solution-mère, 1 mg/mL.

II. Solution de travail, 10 mg/mL.

11. Solutions-étalons de nitrite de sodium :
I. Solution-mère, 500 mg/mL.

II. Solution de travail, 5 mg/mL.

Détermination colorimétrique des nitrates et des nitrites dans les aliments

Mode opératoire : A. Préparation de la courbe d'étalonnage pour le nitrite de sodium

1. Déposer 0,0, 1,0, 2,0, 4,0, 6,0 et 10,0 mL de la solution de travail de NaNO₂ dans des fioles jaugées de 50 mL.

2. Ajouter 10 mL de réactif de coloration, compléter le volume avec de l'eau, mélanger et laisser reposer dans l'obscurité pendant 25 minutes.
3. Régler le spectrophotomètre à 550 nm.
4. Faire la lecture pour les étalons fournis dans des cuves par comparaison avec un blanc (addition de l'étalon exempt de nitrites) (note 5).
5. Bâtir une courbe d'étalonnage en inscrivant la densité optique en regard de la quantité de mg de NaNO₂/50 mL.
6. La gamme des densités optiques devrait s'étendre de 0 à 0,6 approximativement (note 1).

B. Préparation du réducteur Jones modifié
7. Placer de 3 à 5 bâtonnets de zinc dans deux béchers de 800 mL contenant 500 mL de solution de CdSO₄.
8. Retirer les bâtonnets à toutes les 2 ou 3 heures (ou aussitôt qu'il se forme une couche épaisse de cadmium sur leur surface) et en déloger la couche poreuse de cadmium métallique en les frottant l'un contre l'autre (mise en garde : le cadmium doit constamment rester recouvert de solution a queuse).
9. Procéder à la décantation de la solution au bout de 6 à 8 heures.
10. Laver les dépôts avec deux portions de 500 mL d'eau distillée.
11. Transvider le cadmium, avec de l'eau, dans un mélangeur à haute vitesse.
12. Mélanger pendant 2 à 3 secondes.
13. Retenir les particules restant sur un tamis de 8 à 40 mailles.
14. Mélanger de nouveau pour augmenter le nombre de particules.
15. Laver les particules avec du HCl 0,1 N.
16. Remuer occasionnellement avec une tige de verre.
17. Laisser reposer toute la nuit dans l'acide.
18. Remuer une fois pour dégazéifier le mélange.
19. Décanter.
20. Laver avec deux portions de 500 mL d'eau.
21. Remplir le réducteur Jones modifié avec de l'eau.
22. Y placer un tampon de laine de verre.
23. Ajouter du cadmium de façon à remplir la colonne sur une hauteur de 8 à 10 cm.
24. Laisser occasionnellement le liquide s'égoutter de la colonne durant le remplissage sans toutefois en laisser le niveau descendre plus bas que le sommet du lit de cadmium (note 7).
25. Éliminer les bulles du lit de cadmium en tapotant les parois de la colonne.
26. Laver la colonne de cadmium avec 25 mL de solution-tampon de NH₄Cl et laisser ce liquide s'égoutter jusqu'au sommet du lit de cadmium.

C. Vérification de l'efficacité de la colonne de cadmium

27. Mélanger 6 mL de la solution de travail de NaNO₃ (10 mg/mL) et 5 mL de la solution-tampon de NH₄Cl et verser ce mélange dans la colonne de cadmium (note 8).
28. Ajuster le débit à une vitesse de 3 à 5 mL/minute.
29. Une fois la colonne vidée, la laver avec 15 mL d'eau.
30. Recueillir l'éluat et le laver dans une fiole jaugée de 50 mL.
31. Ajouter 5,0 mL d'acide acétique à 60 % (note 6).
32. Ajouter 10 mL de réactif de coloration.
33. Compléter le volume avec de l'eau et mélanger.
34. Laisser reposer dans l'obscurité pendant 25 minutes.
35. Préparer un blanc de la même façon, c'est-à-dire en suivant les étapes de 27 à 34, mais cette fois en prenant 6 mL d'eau (note 9).
36. Procéder à la lecture des extraits sur le spectrophotomètre, à 550 nm.
37. La concentration de NaNO₂, telle que déterminée sur la courbe d'étalonnage, devrait être d'environ 48,7 mg/mL s'il y a conversion complète (note 2).
38. Si le taux de conversion est inférieur à 90 %, reconditionner la colonne en y faisant passer 25 mL de HCl 0,1 N, deux portions de 25 mL d'eau, et 25 mL de solution de NH₄Cl, et reprendre les étapes de 27 à 37 (note 3).
39. Vérifier l'efficacité de chaque colonne une fois par semaine.

D. Préparation des échantillons
40. Retirer tout enrobage ou partie extérieure de l'échantillon de même que toute moisissure de surface.

E. Méthode d'extraction
41. Peser environ 100 g d'échantillon.
42. Défaire l'échantillon en tout petits morceaux.
43. Bien mélanger à la main, ou homogénéiser dans un mélangeur.
44. Prélever 10 g de l'homogénat.
45. Placer cette quantité dans un mélangeur, y ajouter 70 mL d'eau et 12 mL de solution de NaOH à 2% et mélanger jusqu'à l'obtention d'une consistance lisse (environ 5 minutes).
46. Déposer cette bouillie dans une fiole jaugée de 200 mL.
47. Rincer le mélangeur avec de 30 à 50 mL d'eau et ajouter ce liquide dans la fiole jaugée.
48. Bien mélanger en faisant tournoyer la fiole.
49. Prélever une ou deux gouttes de la suspension qui s'est formée dans la fiole et en vérifier le pH à l'aide d'un papier à pH.
50. Si le pH est légèrement alcalin, faire chauffer le contenu de la fiole dans un bain-marie (de 50 à 60 °C) jusqu'à ce que la température de la suspension approche de 50 °C.
51. Si le pH est inférieur à 8, ajouter graduellement de petites quantités de solution de NaOH à 2% jusqu'à ce que le pH se situe entre 8 et 10 puis chauffer la suspension de la façon décrite plus haut.
52. Remuer occasionnellement la suspension pendant le chauffage en faisant tournoyer la fiole.
53. Tenir la température à environ 50 °C pendant encore 10 minutes en mélangeant de temps en temps.
54. Ajouter 10 mL de solution de ZnSO₄.
55. Mélanger en faisant tournoyer la fiole.
56. S'il ne se forme aucun précipité blanc de Zn(OH)₂ après l'addition de la solution de ZnSO_4, ajouter de 2 à 5 mL de solution de NaOH à 2 % et mélanger (éviter toutefois d'en ajouter une trop grande quantité).
57. Refroidir à température de la pièce dans un bain d'eau.
58. Compléter le volume avec de l'eau et bien mélanger.
59. Filtrer sur un papier-filtre strié (Whatman nº 1 ou nº 41, de préférence) (note 4); jeter les premiers 20 mL de filtrat et recueillir le reste dans une fiole de 250 mL munie d'un bouchon de verre.
60. Filtrer de nouveau si l'extrait n'est pas limpide.

F. Détermination des nitrites
61. Déposer une portion de 10 mL de filtrat dans une fiole jaugée de 50 mL.

62. Ajouter 10 mL de réactif de coloration (note 6).
63. Compléter le volume avec de l'eau.
64. Mélanger.
65. Laisser reposer dans l'obscurité pendant 25 minutes.

G. Détermination de la quantité totale de nitrates et de nitrites
66. Mélanger une seconde portion de 10 mL de filtrat avec 5 mL de solution-tampon de NH₄Cl et faire passer dans le réducteur Jones modifié (note 8).
67. Laver la colonne avec environ 15 mL d'eau.
68. Recueillir l'éluat et le laver dans une fiole jaugée de 50 mL.
a) ajouter 5,0 mL d'acide acétique à 60 % (note 6).
69. Ajouter 10 mL de réactif de coloration.
70. Compléter le volume avec de l'eau.
71. Mélanger.
72. Laisser reposer dans l'obscurité pendant 25 minutes.

H. Préparation du réactif blanc
73. Procéder aux étapes de 45 à 72 en utilisant 70 mL d'eau (note 9).

I. Calculs (note 5)
74. Après le développement de la couleur, procéder à la lecture du blanc non réduit et des filtrats d'échantillon par comparaison avec le blanc décrit à l'étape 4.
75. Procéder à la lecture du blanc réduit et des éluats d'échantillon en comparaison avec le même blanc.
76. Soustraire les valeurs du blanc des valeurs correspondantes obtenues pour l'échantillon.
77. Déterminer la concentration de nitrites, dans chaque cas, à partir de la courbe d'étalonnage.
78. Calculer la concentration de nitrites dans les filtrats d'échantillon réduit et non réduit.
79. La différence entre les deux valeurs donne la concentration de nitrates.
80. Enfin, calculer les concentrations de nitrites et de nitrates dans l'échantillon de départ.

Détermination colorimétrique des nitrates et des nitrites dans les aliments

81. Voici un exemple-type :

Exemple	:	Réactif blanc
			NO2 A	= 0
			NO2/NO3 A = 0,01
		échantillon
		de fromage
			NO2 A	= 0,005
			NO2/NO3 A = 0,115

I. Détermination du NaNO₂ :

A (dû au NaNO2)	= A (NO2 de l'échant.) - A (NO2 du blanc)
	= 0,005 - 0
	= 0,005

Selon la courbe d'étalonnage A, 0,005 = 0,5 mg/50 mL. Comme il s'agissait d'une portion de 10 mL, la quantité totale dans

200 mL = (200/10) ´ 0,5 = 10 mg.

Comme le poids de l'échantillon était au départ de 10 g, la concentration de NaNO₂ est de 10 mg/10 g, c'est-à-dire de 1 mg/g, donc de 1 ppm.

II. Détermination du NaNO₃ :

A (dû au NaNO3/NaNO2)	= A(NO3/NO2 de l'échant.) - A (NO3/NO2 du blanc)
	= 0,115 - 0,01
	= 0,105

Selon la courbe d'étalonnage A, 0,105 = 14,75 mg/50 mL. D'après les calculs effectués en I, nous savons que la concentration de NaNO₂ dans l'échantillon est de 0,5 mg/50 mL; le NaNO₂ total provenant du NaNO₃ est donc : 14,75-0,5 = 14,25 mg/50 mL. Comme il s'agissait d'une portion de 10 mL, la quantité de NaNO₂ provenant du NaNO₃, dans 200 mL de solution, est de : (200/10) ´ 14,25 = 285 mg.

Comme le poids de l'échantillon était au départ de 10 g, la concentration de NaNO₂ provenant du NaNO₃ est de 285 mg/10 g = 28,5 mg/g = 28,5 ppm.

Le facteur de conversion du NaNO₂ (P.M. 69) en NaNO₃ (P.M. 85) est de 1,23.

La concentration de NaNO₃ est donc de 28,5 ´ 1,23 = 35 ppm.

Nota : Si les résultats obtenus se situent au-delà de la portée de la courbe d'étalonnage, il faut procéder à des dilutio ns. L'extrait aqueux peut être dilué avec de l'eau avant les étapes 61 et 66 et on doit prélever une portion de 10 mL de la solution diluée aux fins d'analyse. Ne pas diluer les extraits définitifs après le développement de couleur. Il faut également dilue r les blancs d'échantillons de façon appropriée.

Détermination colorimétrique des nitrates et des nitrites dans les aliments

Note 1 : Vérifier toute la courbe d'étalonnage une fois par mois. Chaque jour, pendant l'analyse d'un échantillon, prendre 6 mL de solution-étalon de travail de NaNO₂, y ajouter 9,0 mL de solution-tampon de NH₄Cl et 5,0 mL d'acide acétique à 60 %, ajouter immédiatement 10 mL de réactif de coloration et déterminer la densité optique de la façon décrite. Si cette dernière diffère notablement de la valeur attendue (écart de plus de 10 %), il convient d'apporter les correctifs voulus à la courbe d'étalonnage avant de passer au calcul des résultats. On peut également préparer une nouvelle courbe d'étalonnage à partir de solutions-étalons de travail fraîches.

Note 2 : 85 mg (1 m mole) de NaNO₃ • ⁶⁹ mg (1 m mole) de NaNO₂.

Note 3 :
Reconditionner la colonne de la même façon après chaque analyse et conserver le niveau de cadmium sous celui de la solution-tampon de NH4Cl entre les analyses.

Note 4 : Prendre un papier-filtre sur le dessus, au centre et au fond de la boîte. Plier les trois papiers et les placer dans un entonnoir filtrant. Laver les papiers avec environ 25 mL d'eau distillée. Analyser le filtrat en regard des nitrites et des nitrates de la façon décrite dans la méthode. Si les lectures obtenues sont élevées, choisir des papiers-filtres d'une autre boîte ou d'une autre marque.

Note 5 : Chaque jour, avant de procéder à la lecture des extraits, normaliser le spectrophotomètre à une densité optique de 0 à l'aide d'une solution de 9 mL de tampon de NH₄Cl et de 10 mL de réactif de coloration (sans nitrites) diluée jusqu'à 50 mL avec de l'eau, tel que décrit à l'étape 4.

Note 6 : Comme les nitrites sont instables dans des conditions acides, le réactif de coloration devrait être ajouté immédiatement apr ès l'addition de la solution d'acide acétique à 60 %.

Note 7 : Lorsque le liquide s'écoule de la colonne, le niveau de ce dernier devrait correspondre à peu près (à ± 2 mm) à celui du sommet du lit de cadmium. Pour ce faire, l'orifice du siphon devrait être placé à peu près au même niveau que le sommet du lit de cadmium. Déterminer le volume du liquide emprisonné dans le lit de cadmium plus celui retenu dans le siphon. Le total devrait être de 4 ± 0,2 mL.

Note 8 : La Division de la recherche sur les aliments a découvert que le lit de cadmium retient environ 4,0 mL de solution-tampon. Dans le cas présent, l'addition de 5,0 mL aux 4,0 mL déjà dans la colonne donne un total de 9,0 mL, c'est pourquoi il faut vider la colonne jusqu'au sommet du lit de cadmium juste avant d'ajouter les solutions de nitrates. Comme l'intensité de la couleur définitive dépend du pH, il faut contrôler rigoureusement la quantité totale de tampon employée dans chaque cas.

Note 9 : Si l'on obtient, pour le NO₃, une valeur élevée du blanc sur la colonne de cadmium, procéder ainsi pour retirer le reste du NO₃ absorbé par la colonne :

Verser 50 mL de NaOH 1 N dans la colonne de cadmium.
Laver la colonne avec de l'eau distillée jusqu'à ce que l'effluent soit presque neutre (pH de 7 à 8).
Puis verser 25 mL de HCl 0,1 N et laver de nouveau la colonne avec de l'eau.
Enfin, laver la colonne avec 25 mL de solution-tampon de NH₄Cl. Passer ensuite à l'étape 66 ou 27.
Ces lavages devraient être effectués chaque jour (tôt le matin) et les colonnes devraient être tenues prêtes à être utilisées par la suite. Si les colonnes sont neuves, il n'est pas nécessaire de procéder à ces lavages étant donné qu'elles seront vérifiées pour la première fois.

Bibliographie :

1. Sen, N.P., Donaldson, B. J. Assoc. Offic. Anal. Chem. 61: 1389, 1978.

2. Sen, N.P., Lee, Y.C. et McPherson, M. J. Assoc. Offic. Anal. Chem. 62: 1186, 1979.

3. Sen, N.P. et McPherson, M. J. Food Safety 1 : 247, 1978.

4. Hamilton, J.E. J. Assoc. Offic. Anal. Chem. 59 : 284, 1976.

Réducteur jones modifié

Nota: Le raccord 24/40 de verre pilé et la disque fritté ne sont pas indespensables.

Détermination colorimétrique des nitrates et des nitrites dans les aliments

Le tableau 1 donne les taux de récupération des nitrates et des nitrites ajoutés à différents aliments. Le tableau 2 présente les résultats d'une expérience ultérieurement effectuée dans le même laboratoire, portant sur le taux de récupération des nitrites ajoutés à des viandes fumées ou salées.

Tableau 1

^a valeur non corrigée en fonction de la colonne de cadmium.

^b valeur corrigée en fonction d'une efficacité de 90 % de la colonne de cadmium.

Détermination colorimétrique des nitrates et des nitrites dans les aliments

Tableau 2

^a pH d'une suspension aqueuse composée de 10 g d'échantillon + 100 mL d'eau, après homogénéisation dans un mélangeur.