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Analyse du carbamate de méthyle et du carbamate d'éthyle dans des boissons alcoolisées et d'autres aliments fermentés
Direction générale de la protection de la santé
Bureau d'innocuité des produits chimiques
Ottawa
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(Version PDF - 339 ko)Définition : La présente méthode s'applique à l'analyse quantitative du carbamate de méthyle et du carbamate d'éthyle dans les boissons alcoolisées, le yogourt, la sauce soya, le lait de beurre, les pains et les rôties, conformément à l'article 4 de la Loi sur les aliments et drogues.
Portée : Cette méthode a été évaluée grâce à l'utilisation conjointe d'un tube extracteur et d'une colonne d'alumine-Célite, suivie de CGL avec détection par analyseur d'énergie thermique (en mode N) et (ou) de CG avec SM haute résolution. La récupération des produits de dopage dans la plage de 10 à 50 p.p. milliard variait de 70 à 114 % (tableau 1).
L'ANALYSTE DOIT SE FAMILIARISER AVEC CETTE MÉTHODE EN UTILISANT DES ÉTALONS ET DES ÉCHANTILLONS DOPÉS AVANT D'ENTREPRENDRE L'ANALYSE D'INCONNUS.
Principe : Les échantillons sont soumis à une extraction au dichlorométhane, dans un tube extracteur ou sur une colonne d'alumine-Célite. Le produit d'extraction (extrait) est réduit dans un concentrateur Kuderna-Danish avec une colonne Snyder macro, puis micro. Le concentré est analysé par CGL-AET (en mode N) ou par CG-SM, pour déterminer la quantité de carbamate de méthyle et de carbamate d'éthyle présente. Le concentré pour les échantillons de rôtie doit être analysé par CPG-SM en raison de la présence de nombreux composés azotés, sources d'interférences dans l'analyse CGL-AET.
Mise en garde : Le carbamate de méthyle et le carbamate d'éthyle sont cancérigènes pour les animaux de laboratoire et doivent donc être manipulés avec grande prudence. Pour plus d'information sur les dangers des produits chimiques, voir les notes de mise en garde données dans l'annexe sur la sécurité au laboratoire de l'édition la plus récente des Official Methods of Analysis, de l'Association of Official Analytical Chemists, Arlington, VA, ou d'autres documents connus qui tiennent compte de la sécurité au laboratoire.
Appareillage : 1. Chromatographe Varian à phase gazeuse (Modèle 3400), ou l'équivalent, connecté à un AET (Modèle 502) avec convertisseur d'azote (Modèle 610 Thermedics Inc., Woburn, MA) et équipé des éléments suivants :
(a) deux colonnes capillaires DB-Wax de 30 m (pellicule de 1mm d'épaisseur) en silice fondue (d.i. de 0,53 mm), reliées en série, ou colonne de 60 m de même type;
Mode de fonctionnement
La température du four du CGL a été programmée comme suit :
ii) puis chauffage jusqu'à 150 °C à 3 °C/min. suivi d'un autre chauffage jusqu'à 200 °C à 25 °C/min,
iii) maintien de la température de 200 °C pendant 20 min.
Pression de la chambre à vide de l'AET : 0,5 - 0,6 torr;
Injecteur, 200 °C;
Hélium, gaz porteur, débit de 8 mL/min;
Interface CGL-convertisseur d'azote, 275 °C;
Four du pyrolyseur, 800 °C.
2. CG-MS 2 Systèmes :
Les deux spectromètres de masse fonctionnent en mode de bombardement électronique;
Les deux chromatographes à phase gazeuse sont équipés d'une colonne capillaire DB-Wax de 30 m (d.i., 0,22 mm) en silice fondue (épaisseur de la pellicule : 0,25 mm) (J & W Scientific);
b) SM haute résolution Kratos Concept connecté à un CG de la série Hewlett Packard 5890 (Note 2)
Mode de fonctionnement :
La température du four du CGL a été programmée comme suit :
ii) puis chauffage jusqu'à 150 °C à 5 °C/min, suivi d'un autre chauffage jusqu'à 250 °C à 50 °C/min,
Autres conditions :
i) orifice d'injection, 60 °C,
ii) ligne de transfert CG-SM, 200 °C,
iii) He, gaz porteur, à 20 lb/po2,
iv) température de la source ionique, 200 °C,
v) énergie électronique, env. 55 eV
3. Bain d'eau permettant de maintenir la température de l'eau entre 55 et 60 °C;
4. Concentrateur-évaporateur Kuderna-Danish (K-D) d'une capacité de 250 mL, avec connexion de colonne 24/40 et joint inférieur de 19/22, complet avec les ressorts (Kontes, no de cat. 570000);
5. Tube concentrateur K-D d'une capacité de 4 mL, avec joint 19/22 et subdivisions de 0,1 mL de 0 à 2,0 (Kontes, no de cat 570050);
vérifier la justesse des graduations;
6. Bouchons Pennyhead (joint 19/22) pour tubes concentrateurs (Kontes, no de cat 850500);
7. Colonne Snyder - 3 sections, 225 mm, avec joints 24/40 (Kontes no. de cat. 503000);
8. Microcolonne Snyder, 3 chambres, avec joints 19/22 (Kontes no. de cat. 569000-0319);
9. Microseringues, 10 µmL;
10. Tubes extracteurs Chem Elut, 20mL;
11. Colonne chromatographique, 29,5 mm ´ 400 mm;
12. Tige-poussoir et entonnoir (figure 1).
Réactifs :
1. Solvants de qualité réactif, distillés dans le verre;
Dichlorométhane (DCM), n-pentane, n-hexane, éthanol et acétate d'éthyle;
2. Chlorure de sodium (NaCl), qualité réactif;
3. Sulfate de sodium, anhydre, qualité réactif;
4. Célite 545 (non lavée à l'acide), préparée (Note 3);
5. Alumine neutre pour chromatographie sur colonne (ICN Biomedicals), désactivée (Note 4);
6. Eau distillée (H2O);
7. Étalons
Carbamate d'éthyle et carbamate de méthyle (Aldrich),
B. Dilution de la solution-mère à 10,0 µmg/mL. Transférer 1 mL de la solution-mère dans une fiole jaugée de 100 mL, diluer en complétant jusqu'au trait de jauge avec le l'acétate d'éthyle et bien mélanger;
C. Étalons d'analyse et solutions de dopage Préparer les étalons d'analyse et les solutions de dopage suivants, par des dilutions sérielles appropriées de la solution-mère avec de l'acétate d'éthyle : 0,05, 0,10, 0,50 et 1,0 µg/mL.
Mode opératoire : Préparation de l'échantillon et extraction
A. Boissons alcoolisées
i) Méthode du tube extracteur :
2. Laver le contenu du tube avec 50 mL d'une solution de DCM:n-pentane (20:80) et jeter le liquide de lavage;
3. Éluer avec en tout 100 mL de DCM, en ajoutant des portions de 15 à 20 mL à la fois;
4. Recueillir l'éluat directement dans le concentrateur K-D, comme il est décrit à l'étape E.3;
5. Ajouter 0,5 mL d'éthanol ou d'acétate d'éthyle pour la conservation;
6. Concentrer l'extrait en suivant les étapes E.4 à E.14;
ii) Méthode de la colonne à Célite-alumine
2. Ajouter à la colonne 10 g d'alumine neutre désactivée, suivie de 40 g de sulfate de sodium anhydre;
3. Introduire à l'aide d'une pipette 10 mL d'échantillon (Note 5) dans un bécher de 250 mL;
4. Ajouter 15 g de Célite 545 préparée, et mélanger à l'aide d'une spatule jusqu'à uniformité;
5. Placer la tige-poussoir dans la colonne et introduire la poudre à l'aide de l'entonnoir, l'extrémité de la tige traversant et dépassant l'entonnoir;
6. Charger, puis tasser le mélange Célite-boisson par petites quantités à la fois, jusqu'à ce que le transfert soit complet;
7. Avant de retirer la tige-poussoir, laver la colonne avec 50 mL d'une solution de DCM:n-pentane (20:80) (v/v), en la versant dans la colonne à travers l'entonnoir;
8. Régler le robinet pour avoir un débit de 1 ou 2 gouttes/s, et jeter les eaux de lavage;
9. Ajouter 100 mL de DCM au bécher, brasser à l'aide d'une spatule et verser le contenu dans la colonne à l'aide de l'entonnoir;
10. Recueillir les 100 mL d'éluat au DCM directement dans le concentrateur K-D, comme il est indiqué dans l'étape E.3;
11. Ajouter 0,5 mL d'éthanol ou d'acétate d'éthyle pour la conservation;
12. Concentrer l'extrait en suivant les étapes E.4 à E.14;
B. Sauce soya
C. Pains et rôties
2. Homogénéiser 10 g d'échantillon avec 15 mL de H2O saturé de NaCl;
3. Suivre les instructions correspondant à la méthode de la colonne de Célite-alumine (étapes A.ii) 1 à A.ii) 10 inclusivement), excepté l'étape A.ii) 3 où il faut utiliser l'homogénat de l'étape C.2 ci-dessus, et l'étape A.ii) 7 où il faut laver la colonne avec 100 mL d'une solution de DCM:n-pentane (20:80) (v/v);
4. Ajouter 0,5 mL d'éthanol (ne pas employer d'acétate d'éthyle) pour la conservation (Note 6);
5. Concentrer l'extrait en suivant les étapes E.4 à E.14;
D. Yogourt et lait de beurre
2. Suivre les instructions correspondant à la méthode de la colonne de Célite-alumine (étapes A.ii) 1 à A.ii) 10 inclusivement), excepté l'étape A.ii) 3 où il faut utiliser l'homogénat en entier de l'étape D.1 ci-dessus, et l'étape A.ii) 7 où il faut laver la colonne avec 100 mL d'une solution de DCM:n-pentane (20:80) (v/v);
3. Ajouter 0,5 mL d'éthanol (ne pas employer d'acétate d'éthyle) pour la conservation (Note 6);
4. Concentrer l'extrait en suivant les étapes E.4 à E.14;
E. Concentration de l'éluat (extrait)
2. Tout en connectant le tube, mouiller le joint avec du DCM et fixer les ressorts;
3. Recueillir l'éluat (extrait) directement dans le montage du concentrateur K-D, décrit ci-dessus;
4. Ajouter un minuscule régulateur d'ébullition (" Boileezer " de 1-2 mm) au contenu de la fiole;
5. Monter une colonne Snyder à 3 sections et concentrer l'extrait à env. 4 mL en chauffant la fiole dans un bain d'eau à 55-60 °C (Note 7);
6. Soulever la fiole au-dessus de l'eau et laisser le DCM condensé dans la colonne Snyder refluer dans la fiole;
7. Ajouter env. 1 mL de DCM par le haut de la colonne Snyder et laisser couler dans la fiole;
8. Déconnecter le tube concentrateur de 4 mL de la fiole;
9. Ajouter un autre petit morceau de " Boileezer " au contenu et fixer la microcolonne Snyder et les ressorts;
10. Concentrer l'extrait à env. 0,8 mL en chauffant le tube concentrateur dans un bain d'eau à 55-60 °C (Note 8);
11. Rincer la microcolonne Snyder avec quelques gouttes de DCM et laisser le liquide de rinçage s'écouler dans le tube;
12. Déconnecter la colonne;
13. Ajuster le volume extrait à 1,0 ou 1,1 mL avec du DCM, en évitant de dépasser 1,1 mL;
14. Boucher le tube, mélanger le contenu à l'aide d'un mélangeur à vortex et conserver à l'obscurité à 4 °C jusqu'au moment de l'analyse;
F. Transfert de phase et partage liquide-liquide
1. Ajouter 2 mL de H2O et un grain régularisateur d'ébullition frais à l'extrait concentré de 1 mL et monter à nouveau une microcolonne Snyder;
2. Chauffer le tube concentrateur avec son contenu dans un bain d'eau à 55-60 °C jusqu'à ce que la majeure partie du DCM soit chassée;
3. Retirer la microcolonne Snyder et chauffer le tube concentrateur avec son contenu pendant 2 à 5 min supplémentaires dans le bain d'eau jusqu'à ce que les dernières traces de DCM aient disparu;
4. À l'aide d'une pipette Pasteur, transférer quantitativement l'extrait aqueux dans un entonnoir à décantation de 20 mL;
5. Rincer le tube concentrateur avec deux fractions de 2 mL de H2O et deux fractions de 2 mL de n-hexane, en transférant les liquides de rinçage dans un entonnoir de décantation de 20 mL;
6. Agiter délicatement le contenu de l'entonnoir pendant env. 2 min, puis laisser les couches se séparer; 7. Décanter avec soin la couche aqueuse inférieure et la recueillir dans un tube de centrifugation de 15 mL, compléter à env. 10 mL avec du H2O;
8. Saturer la solution de 10 mL avec du NaCl en ajoutant env. 4 g de NaCl;
9. Verser le mélange dans un tube extracteur Chem Elut de 20 mL et laisser reposer pendant 5 min;
10. Éluer avec 5 ´ 20 mL de DCM et recueillir l'éluat directement dans le concentrateur K-D, comme le décrit l'étape E.3; utiliser plusieurs portions du DCM pour rincer le tube de centrifugation de 15 mL et verser le liquide de rinçage sur le tube extracteur Chem Elut;
11. Ajouter 0,5 mL d'éthanol ou d'acétate d'éthyle aux éluats combinés;
12. Concentrer l'extrait en suivant les étapes E.4 à E.14;
G. Réactifs à blanc
2. Utiliser 10 mL d'une solution à 10 % (v/v) d'alcool dans H2O comme réactif à blanc pour les boissons alcoolisées, à la place de la fraction d'échantillon;
3. Préparer les blancs pour les autres matrices d'échantillons en employant les quantités de réactifs précisées, mais en omettant l'échantillon;
4. Effectuer les essais à blanc avec les échantillons correspondants en suivant tout le mode opératoire se terminant par l'étape E.14;
H. Obtention d'une courbe d'étalonnage
2. Avec cette valeur d'atténuation, analyser en double des factions de 2 µmL de chaque étalon renfermant 0,05, 0,10, 0,5 et 1,0 mg/mL (Note 10);
3. Mesurer avec précision la hauteur des pics (± 0,1 cm) et calculer la hauteur moyenne des pics correspondant à 2 injections pour chaque concentration (Note 11);
4. Tracer une courbe d'étalonnage représentant la hauteur des pics en fonction de la quantité de pg injectée;
5. Obtenir une courbe d'étalonnage pour la CG-SM en utilisant une méthode comparable à celle décrite ci-dessus, excepté que l'on injecte des fractions de 1 µmL;
I. Analyse des échantillons
2. Mesurer la hauteur des pics et calculer la moyenne correspondant à l'injection de 2 µmL;
3. Comparer cette hauteur de pic à une courbe d'étalonnage préparée récemment et déterminer laquelle des solutions étalons, lorsqu'elle est injectée à la même valeur d'atténuation , donne la hauteur de pic la plus proche;
4. Choisir la solution étalon, injecter des fractions de 2 µmL, en double, et déterminer la hauteur moyenne des pics;
5. Pour les analyses par CG-SM, injecter à chaque fois des fractions de 1 µL.
J. Calculs
H1 x P x V2
p.p. milliard = --------------------
H2 x G x V1
où
H2 est la hauteur moyenne du pic en cm correspondant à l'étalon de produit à analyser
P est le poids en pg de l'étalon de produit à analyser, qui a donné H2
V1 est 2µL, excepté pour la CG-SM où on utilise 1µL
V2 est 1 mL
G est le nombre de grammes d'échantillon prélevé
Note 1. Ce système CG-SM est utilisé pour l'analyse d'extraits de boissons alcoolisées, de certains pains et rôties, et de sauce soya.
Note 2. Ce système CG-SM est utilisé pour l'analyse d'extraits d'autres rôties, ainsi que de yogourt et de lait de beurre.
Note 3. Chauffer la Célite 545 pendant 16 h à 600 °C, puis laisser refroidir à la température de la pièce dans un dessiccateur.
Note 4. Chauffer l'alumine neutre pendant 16 h à 400 °C, puis laisser refroidir à la température de la pièce dans un dessiccateur. Désactiver en mélangeant avec 10 % p/p de H2O, conserver dans une fiole bouchée et laisser reposer pendant la nuit.
Note 5. Pour les vins, prendre des fractions de 10 mL, mais dans le cas d'autres échantillons, il faut, avant de les introduire dans le tube extracteur, procéder comme suit : Diluer 5 mL de sherry à 10 mL avec H2O, ajouter 2 g de NaCl et mélanger intimement. Diluer 2 mL de boisson alcoolisée renfermant > 30 % d'alcool à 10 mL avec H2O, ajouter 2 g de NaCl et mélanger intimement.
Note 6. L'éthanol de nature plus polaire doit être utilisé pour faciliter la dissolution dans la phase H2O et permettre la purification ultérieure par transfert de phase et partage.
Note 7. Au début, maintenir le niveau de l'eau à l'extérieur au voisinage de celui du DCM à l'intérieur de la fiole et continuer à chauffer jusqu'à ce que l'extrait concentré soit de 4 mL environ. Si, au cours de la concentration, l'ébullition devient excessive, la réduire en soulevant légèrement la fiole ou en abaissant la température du bain d'eau.
Note 8. Soulever ou immerger le tube dans l'eau pour diminuer l'ébullition, mais ne pas le sortir complètement, car cela arrêterait l'action du régulateur (" Boileezer "). Éviter toute surchauffe et toute accumulation excessive de DCM dans les chambres de la colonne. Arrêter la concentration à 0,8 mL de DCM. Ne pas concentrer à moins de 0,8 mL.
Procéder lentement à la concentration finale, dont la durée doit être d'au moins 30 min. À la fin, soulever le tube, le fond touchant encore l'eau, laisser s'écouler le liquide et consigner le volume pour confirmer qu'il est bien de 0,8 mL. Si le volume est > 0,8 mL, continuer la concentration comme précédemment.
Note 9. La méthode de partage liquide-liquide n'est requise que pour les extraits de pain, de rôtie, de yogourt et de lait de beurre, pour éliminer tout lipide ou graisse qui pourraient être présents.
Note 10. Avant l'injection, tirer légèrement le piston de la seringue et noter le volume exact d'échantillon ou d'étalon à injecter. Il doit y avoir un volume d'air entre la solution à injecter et le solvant de rinçage déjà présent dans l'aiguille. Pendant l'injection, s'assurer qu'il n'y a aucune perte d'échantillon ou d'étalon par contre-pression. Après l'injection, maintenir l'aiguille dans le septum pendant env. 5 s avant de la retirer.
Note 11. S'il n'y a pas injection d'une quantité exacte de 2 µL, apporter les corrections appropriées en convertissant toutes les hauteurs de pics en équivalents correspondant à des injections de 2 µL.
Note 12. L'atténuation pourrait varier de 8 à 128 selon la concentration du produit à analyser.
Références
1. Sen, N.P., Seaman, S.W., Boyle, M. and Weber, D., Methyl Carbamate and Ethyl Carbamate in Alcoholic Beverages and other Fermented Foods, Food Chemistry (accepté pour publication)
2. Sen, N.P., Seaman, S.W. and Weber, D., A Method for the Determination of Methyl Carbamate and Ethyl Carbamate in Wines, Food Additives and Contaminants, 9, 149, (1992)
3. Canas, B.J., Havert, D.C. and Joe, F.L. Jr., Rapid Gas Chromatographic Method for Determining Ethyl Carbamate in Alcoholic Beverages with Thermal Energy Analyzer Detection, J. Assoc. Offic. Anal. Chemists, 71, 509 (1988)
Tableau 1
Récupération de CM et de CE à partir de boissons alcoolisées, de sauce soya, de pain et de rôties, et de yogourt
| Échantillon | Conc. de dopage (x10-9) |
Méthode utilisée pour l'analysea | % de récupérationb | |
|---|---|---|---|---|
| CM | CE | |||
| Boissons alcoolisées | ||||
| Vin | 10 | A | 74 | 114 |
| Vin | 20 | A | 75 | 103 |
| Vin | 20 | A | 94 | 101 |
| Vin | 20 | A | 71 | 98 |
| Gin | 50 | B | 85 | 96 |
| Vodka | 50 | B | 94 | 108 |
| Sauce soya | ||||
| Sauce soya aux champignons | 10 | B | 60 | 59 |
| Sauce soya | 20 | B | 98 | 93 |
| Sauce soya | 20 | B | 120 | 108 |
| Pains et rôties | ||||
| Pain blanc | 16 | C | 67 | 86 |
| Rôtie de pain blanc | 16 | C | 86 | 90 |
| Pain cuit en galette | 10 | C | 88 | 115 |
| Rôtie de pain de blé entier | 16 | C | 76 | 71 |
| Rôtie de pain blanc | 10 | C | 96 | 114 |
| Rôtie foncé de pain genre italien | 36 | C | 69 | 96 |
| Yogourt | ||||
| Yogourt naturel aux pêches | 16 | C | 71 | 80 |
| Yogourt aux bleuets | 16 | C | 83 | 124 |
a Méthodes employées : A, extraction Chem Elut suivie de détection par AET (N); B, fractionnement sur Célite + alumine neutre (10 % de teneur en eau), suivi de CG-SM; C, comme en B, avec en plus le partage liquide-liquide pour éliminer les graisses et les lipides.
b Les concentrations de CM et de CE présents dans les échantillons non dopés ont été soustraits avant le calcul du taux de récupération.
