Dosage fluorimétrique de la vitamine A dans les produits laitiers

Laboratoire de la direction générale de la protection de la santé
Bureau des sciences de la nutrition
Ottawa

LPFC-200
Décembre 1986
Méthode de laboratoire

Si vous avez besoin d'aide pour accéder aux formats de rechange, tels que Portable Document Format (PDF), Microsoft Word et PowerPoint (PPT), visitez la section d'aide sur les formats de rechange.

---

Définition:

Cette méthode est applicable au dosage de la vitamine A dans le lait écrémé, le lait écrémé évaporé, le lait partiellement écrémé et évaporé, le lait écrémé en poudre, le lait écrémé aromatisé, le lait partiellement écrémé aromatisé, le lait écrémé condensé et à d'autres produits de lait écrémé ou partiellement écrémé conformément aux articles B.08.004, 005, 011, 012, 014, 017, 018, 019, 020, 023 et 026 du Règlement sur les aliments et drogues.

Portée:

Cette méthode a été largement utilisée pour mesurer la teneur en vitamine A du lait écrémé, du lait partiellement écrémé et des produits apparentés au lait écrémé et au lait partiellement écrémé. On trouvera des données concernant la précision, l'exactitude et la récupération dans la référence 1 et dans les tableaux 1 à 4.

L'ANALYSTE DOIT SE FAMILIARISER AVEC CETTE MÉTHODE A L'AIDE D'ÉTALONS OU D'ÉCHANTILLONS DOPÉS AVANT D'ENTREPRENDRE L'ANALYSE D'ÉCHANTILLONS INCONNUS.

Principe:

Les échantillons sont saponifiés pour transformer les esters du rétinol en rétinol et pour détruire les substances parasites. Le rétinol libre est extrait à l'aide d'hexane et est mesuré par spectroflurimétrie (1) (2).

Mise en garde:

Les produits chimiques peuvent être dangereux à plusieurs titres et doivent être manipulés avec soin. Pour obtenir des détails concernant les dangers que représentent les produits chimiques, consulter les précautions à prendre figurant dans le chapitre 51 (Sécurité au laboratoire), du manuel Official Methods of Analysis, de l'Association of Official Analytical Chemists, Arlington, V.A., quatorzième édition (1984) et d'autres documents approuvés traitant de la sécurité au laboratoire.

Appareillage:

1. Spectrofluorimètre, Perkin Elmer LS-5 ou l'équivalent;
   
   
2. Centrifugeuse de table;
   
   
3. Bain-marie à température contrôlée à 80ºC;
   
   
4. Pipette automatique, Oxford Micro-pipetting System ou l'équivalent, réglé à 1,2 et 5 mL;
   
   
5. Tubes à saponification:
   
   
   1. tubes à centrifuger gradués de 15 mL avec bouchon rodé,
      
      
   2. joint rodé (pièce mâle 14/35 Pyrex nº 6560), muni d'une tige de 10 cm de longueur, utilisé tel quel comme condenseur à air;
      
      
6. Mélangeur Vortex;
   
   
7. Gants de latex nitrile, Fisher nº 11-394-23;
   
   
8. Pipette Pasteur, à usage unique, et poire en caoutchouc;
   
   
9. Lunettes de protection;

Reagents:

1. Pipettes jaugées de 1,0 et 2,0 mL pour diluer l'étalon. Réactifs: 1. Étalon de référence de vitamine A, U.S.P., United States Pharmacopeial Convention, Inc., Rockville (Maryland), 20852;
   
   
2. Hexane, qualité CLHP;
   
   
3. Éthanol à 95 % ou anhydre,
   
   
   1. distiller sur du AgNO₃ solide (environ 2,5 g/100 mL) et des pastilles de KOH (environ 5,0 g/100 mL); jeter la première fraction et recueillir le liquide qui distille à 78,5^ºC;
      
      
   2. conserver dans un flacon avec bouchon en verre;
      
      
4. Pyrogallol, solution a 1 % p/v dans 1'éthanol (réactif 3);
   
   
5. Pastilles de KOH (pastilles d'environ 100 mg);
   
   

6. Antimousse, antifoam FC-10 ou l'équivalent.
   

Méthode:

Le laboratoire doit être éclairé avec un tube fluorescent or ou une lampe à incandescence pour éviter de détruire la vitamine A.

A. Analyse:

I. Préparations préliminaires:

1. Distiller l'éthanol sur du KOH et du AgNO₃ (réactif 3);
   
   

2. Préparer la solution de pyrogallol dans l'éthanol (1 % p/v) la solution doit être fraîchement préparée;

3. Chauffer le bain-marie à 80ºC;
   
   
4. Rincer avec de l'hexane un condenseur à air et un tube à centrifuger pour chaque échantillon et chaque blanc;
   
   
5. Allumer le spectrofluorimètre 30 minutes avant de prendre les lectures;
   
   

6. Régler le spectrofluorimètre à une excitation de 330 nm et à une émission de 480 nm, et les deux fentes à une bande passante de 10 nm (8 nm s'il s'agit d'un spectrofluorimètre autre que le LS-5);

7. Vérifier que les cuvettes soient propres et sèches; laver au besoin avec de l'eau savonneuse et rincer avec de l'eau distillée, de l'alcool et. finalement de l'hexane.
   
   II. Préparation des étalons:
   
   
8. Couper le bout d'un étalon de référence de vitamine A U.S.P. et verser la solution huileuse dans un flacon jaugé taré de 25 mL; peser à nouveau pour déterminer le poids (± l mg) de la solution huileuse (habituellement autour de 220 mg);
   
   
9. Diluer la solution huileuse dans de l'hexane, diluer au volume, bien mélanger et étiqueter "solution A";
   
   
10. Diluer 1,0 mL de solution A à 10 mL avec de l'hexane en utilisant un ballon jaugé de 10 mL, bien mélanger et étiqueter "solution B";
    
    
11. Diluer 1,0 ml de solution B à 50 mL avec la solution de pyrogallol à 1 % p/v dans l'éthanol (réactif 4) en utilisant un ballon jaugé de 50 mL, bien mélanger et étiqueter "solution C";
    
    
12. Pipetter 1,0 mL d'eau distillée, 2,0 mL de solution C et ajouter 0,5 g de KOH (5 pastilles, réactif 5) dans trois tubes à saponification;
    
    
13. Saponifier et extraire selon les directives concernant les échantillons au début de la section IV, à l'étape 34;
    
    
14. Pour préparer une courbe étalon, diluer 1 à 5 mL de solution C à 10 mL, avec le réactif 4 et procéder selon les directives concernant l'étalon (section IV, étape 34).
    
    III. Préparation des échantillons:
    
    (a) Lait écrémé ou partiellement écrémé:
    
    
15. Laisser les échantillons parvenir à la température de la pièce (22ºC);
    
    
16. Si l'échantillon est contenu dans un seul récipient, agiter le récipient avant de l'ouvrir et pipetter les aliquotes pour l'analyse;
    
    
17. Si l'échantillon est contenu dans plus d'un récipient, pipetter les aliquotes de chaque récipient ou réunir 100 mL d'aliquotes dans un bécher approprié;
    
    
18. Remuer à fond avec une tige de verre tout en évitant de faire mousser;
    
    
19. Pipetter des portions de 1,0 mL pour l'analyse immédiatement après avoir mélangé l'échantillon.
    
    (b) Lait écrémé ou partiellement écrémé condensé ou évaporé:
    
    
20. Préparer selon les directives pour le "lait écrémé ou partiellement écrémé"mais diluer 2 volumes dans 5 volumes avant l'analyse;
    
    
21. Lorsque la déclaration sur l'étiquette est en U.I. par 100 g, mesurer la densité à l'aide d'un densitomètre ou diluer 20 g dans 50 mL pour l'analyse;
    
    (c) Lait écrémé ou partiellement écrémé en poudre:
    
    
22. Mélanger l'échantillon dans un sac de plastique;
    
    
23. Peser 100 g et transférer dans un ballon jaugé de 1000 mL;
    
    
24. Ajouter 1 g d'antimousse (par ex. antifoam FG-10);
    
    
25. Ajouter une barre magnétique enduite de téflon (3 cm x 1 cm de diamètre, volume d'environ 3 mL);
    
    
26. Ajouter de l'eau distillée, purger l'air du ballon avec de l'azote et remuer jusqu'à ce que ce soit homogène;
    
    
27. Diluer à la marque avec de l'eau distillée et laisser reposer jusqu'à ce que le volume ne varie plus;
    
    
28. Diluer à la marque de nouveau;
    
    
29. Répéter les étapes 27 et 28 jusqu'à ce qu'il n'y ait plus de variation;
    
    
30. Bien mélanger le contenu du ballon par inversion et prendre immédiatement des aliquotes pour l'analyse;
    
    
31. Selon la déclaration sur l'étiquette, il peut être nécessaire de mesurer la densité de la poudre et du lait reconstitué
    
    
32. Aux fins de cette méthode, on peut présumer que la densité moyenne du lait reconstitué est égale à 1,03;
    
    IV. Saponification et extraction:
    
    
33. À l'aide de pipettes automatiques pour distribution de liquide, ajouter les quantités suivantes à chaque tube de saponification:
    
    
    1. 0,5 g (5 pastilles) de KOH, (2)
       
       
    2. 2,0 mL de solution de pyrogallol dans l'éthanol (1 % p/v); (3) 1,0 mL d'échantillon ou
       
       
    3. 1,0 mL d'eau distillée pour le blanc;
       
       
34. Mélanger à fond à l'aide d'un mélangeur Vortex (environ 30 s);
    
    
35. Brancher un condenseur à air;
    
    
36. Placer dans un bain-marie à 80ºC pendant 20 min;
    
    
37. Le contenu doit chauffer lentement à reflux. (Il ne doit pas y avoir réduction importante du volume. Dans le cas contraire, le tube a été surchauffé et doit être rejeté.);
    
    
38. Ajouter 2 mL d'eau distillée;
    
    
39. Enlever les condenseurs;
    
    
40. Boucher les tubes;
    
    
41. Laisser refroidir dans l'obscurité (les échantillons peuvent être conservés jusqu'au lendemain à la température de la pièce et sous azote à cette étape.);
    
    
42. Ajouter 5 mL d'hexane;
    
    
43. Reboucher les tubes;
    
    
44. Mélanger à fond pendant 30 secondes à l'aide d'un mélangeur Vortex;
    
    
45. Centrifuger à environ 1000 tpm pendant 3 min;
    
    
46. Transférer la phase supérieure d'hexane à l'aide d'une pipette Pasteur dans un ballon jaugé de 10 mL;
    
    
47. Répéter l'extraction avec une autre portion de 5 mL d'hexane;
    
    
48. Combiner les extraits;
    
    
49. Ajuster le volume à 10 mL avec de l'hexane et bien mélanger;
    
    
50. Prendre les lectures au spectrofluorimètre moins d'une heure après;
    
    
51. Transférer la phase supérieure d'hexane à l'aide d'une pipette Pasteur dans un ballon jaugé de 10 mL;
    
    
52. Répéter l'extraction avec une autre portion de 5 mL d'hexane;
    
    
53. Combiner les extraits;
    
    
54. Ajuster le volume à 10 mL avec de l'hexane et bien mélanger;
    
    
55. Prendre les lectures au spectrofluorimètre moins d'une heure après;
    
    V. Mesure de la fluorescence à l'aide d'un spectrofluorimètre:
    
    
56. Rincer les cuvettes à l'hexane;
    
    
57. Laisser sécher;
    
    
58. Prendre la lecture des échantillons, des étalons et des blancs (qui devrait donner de 2 à 5 unités) et de l'hexane (qui devrait donner environ 1 unité);
    
    VI. Calcul:
    
    
59. Soustraire la valeur du blanc de la valeur de chaque échantillon ou étalon;
    
    
60. Calculer les valeurs équivalentes aux étalons de la façon suivante:
    
    Valeur équivalente (unités/échantillon de 100 mL) - (W x P)/62,5 où W - poids de la solution huileuse en mg,
    
    P - activité de la solution huileuse (unités/ mg) déclarée sur l'étiquette de l'étalon de référence de vitamine A U.S.P.;
    
    
61. Calculer la valeur des échantillons en comparant les lectures avec celles des étalons.

Références:

1. The Fluorometric Determination of Vitamin A in Dairy Products. Thompson, J.N., Erdody, P., Maxwell, W.B. et Murray, T.K.,J.DairySci.,55, 1077, (1972).
   
   
2. Destruction by Light of Vitamin A in Dairy Products, Thompson, J.N. et Erdody, P. J. Can. Inst. Food Sci. and Technol., 7, 157, (1974).
   
   
3. Chapitre sur la vitamine A Parrish, D.B., Moffitt, R.A., Noel, R.J. et Thompson, J.N. Methods of Vitamin Assay (p. 153-184) Augustin, J., Klein, B.P., Beckewr, D.A. et Venugopal, P.B. eds. Quatrième édition. 1985 John Wiley and Sons, New York

Évaluation de la méthode

Exactitude

Le lait renferme toujours de la vitamine A provenant de sources naturelles qui est mesurée en même temps que la vitamine ajoutée par les laiteries. Il est donc difficile d'obtenir un échantillon de composition connue pour vérifier la validité des méthodes. L'exactitude de la méthode LPFC-200 doit être mesurée indirectement à partir d'une, étude des sources possibles d'erreur. Nous n'avons observé que des traces de substances parasites dans la chromatographie des extraits de lait préparés selon la méthode. Il y a toujours production d'une petite quantité de lipides fluorescents à partir des contaminants présents dans l'éthanol utilisé pour digérer l'échantillon, et ces contaminants sont mesurés dans le "blanc". Les valeurs du "blanc" sont habituellement réduites de façon significative lorsque l'éthanol est purifié de la façon décrite dans la méthode avant d'être utilisée. Toutefois, la surchauffe du digestat produit de grandes quantités de substances fluorescentes. En comparant les résultats obtenus avec la méthode LPFC-200 et ceux obtenus avec une méthode de CLHP publiée récemment (1986), on peut penser que la méthode fluorimétrique surestime probablement la teneur véritable en rétinol d'environ 10 % (tableau 1).

Tabeau 1 - Comparaison des résultats obtenus avec la méthode LPFC-200 et la méthode de CLHP pour la concentration de rétinol dans onze échantillons de lait enrichi

Visionnez la table Comparaison des résultats obtenus avec la méthode LPFC-200 et la méthode de CLHP pour la concentration de rétinol dans onze échantillons de lait enrichi

Récupération

La récupération ne doit pas être mesurée en ajoutant de la vitamine A pure à du lait. La vitamine ne se disperse pas facilement, elle s'oxyde rapidement et adhère aux parois de verre. La vitamine peut être ajoutée sous forme de préparation commerciale dispersable, mais ces préparations doivent être, dosées par une autre méthode pour déterminer la quantité de vitamine A qui a été ajoutée. La référence (1) décrit une épreuve de cette nature.

Précision

Le tableau 2 présente les variations des résultats observés dans un laboratoire après plusieurs analyses du même échantillon.

Tableau 2 - Variation des résultats de dosages en parallèle réalisés dans un laboratoire

Visionnez la table Variation des résultats de dosages en parallèle réalisés dans un laboratoire

La vitamine doit être uniformément répartie dans le lait et la variation n'augmente habituellement pas lorsqu'on examine différents échantillons
provenant du même lot de production (tableau 3).

Tableau 3 - Variation des résultats obtenus par un même laboratoire pour le dosage de différents échantillons provenant du même lot de production

Visionnez la table Variation des résultats obtenus par un même laboratoire pour le dosage de différents échantillons provenant du même lot de production

Le tableau 4 présente les variations obtenues par différents laboratoires dans les analyses de routine.

Tableau 4 - Variation des résultats obtenus par différents laboratoires dans le dosage d'échantillons de contrôle de lait (Unités/100 mL)

Visionnez la table Variation des résultats obtenus par différents laboratoires dans le dosage d'échantillons de contrôle de lait (Unités/100 mL)