Supplément à la procédure d'élaboration et de gestion des méthodes microbiologiques dans les aliments

Annexe 4.5

mai 2011

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Détermination de la limite de détection

1. Application

La présente annexe à la Procédure d'élaboration et de gestion des méthodes microbiologiques dans les aliments du Compendium de méthodes décrit le protocole expérimental à utiliser pour satisfaire aux exigences établies par le Comité des méthodes microbiologiques en matière de détermination de la limite de détection (LD) d'une méthode qualitative indirecte. D'autres protocoles de détermination de la limite de détection (LD) peuvent être utilisés, mais ils seront évalués au cas par cas, si les critères ont été respectés.

2. Procédure

La LD est déterminée au moyen de l'inoculation artificielle des matrices alimentaires, à une plage de concentrations connues pour l'organisme ciblé. Plusieurs répétitions sont analysées à chaque niveau d'inoculation. À la suite de l'équilibration des cellules, la méthode alternative est appliquée à chaque portion analytique. Il n'est pas nécessaire d'effectuer une méthode de référence parallèlement à la méthode alternative, mais la confirmation est requise. En outre, la détermination du nombre le plus probable (NPP) pour concentrations de l'analyte ciblé est effectuée sur la niveau d'inoculation la plus élevée. La concentration de la cellule ciblée aux niveaux plus faibles est extrapolée des résultats de la détermination du NPP. La LD se situe entre les deux niveaux d'inoculation qui produisent respectivement une récupération inférieure et supérieure à 50 %.

2.1 Nombre de catégories d'aliments

Au moins un type d'aliment de chaque catégorie visée par l'étude de collaboration préalable doit être analysé. Pour chaque type d'aliment, sélectionner un aliment qui représente le plus fidèlement possible le type. Au moins un type d'aliment doit être un aliment complexe, p. ex. un aliment qui possède une importante flore de fond, un aliment composé de plusieurs ingrédients, un aliment auquel des agents de conservation ont été ajoutés et/ou un aliment exposé au milieu de transformation.

2.2 Organismes ciblés

Une seule souche doit être utilisée pour chaque type d'aliment, et chaque type d'aliment doit être inoculé avec une souche différente. Si possible, la souche sélectionnée doit être associée à l'aliment en question.

2.3 Préparation et analyse de l'échantillon

Le laboratoire doit analyser au moins trois niveaux d'inoculation, mais il est conseillé d'en analyser quatre ou cinq pour augmenter la probabilité de la réussite de l'expérience. Chaque niveau d'inoculation doit comporter six répétitions. Le laboratoire doit préparer des portions analytiques individuelles dans des sacs Stomacher ou un autre contenant convenable. Le laboratoire doit également préparer une dilution en série de l'analyte ciblé à environ la LD escomptée. Les dilutions par deux sont suggérées, mais non exigées. Le laboratoire doit inoculer chaque série de six répétitions avec une dilution et équilibrer les cellules, conformément aux directives de la section 4.8 de la partie 4. Ne pas utiliser de cellules agressées (stressées) pour la fortification.

La concentration des cellules ciblées après équilibration doit être déterminée pour chaque niveau d'inoculation. À cette fin, le laboratoire doit préparer six répétitions supplémentaires à concentration élevée. Le laboratoire doit combiner ces portions dans trois échantillons de 50 grammes et équilibrer (voir plus haut dans le texte).

2.4 Analyse de l'échantillon - méthode alternative

Le laboratoire doit analyser tous les échantillons par la méthode alternative, sauf les portions de 50 grammes. Les résultats obtenus pour tous les échantillons doivent être confirmés à l'aide d'une méthode de référence acceptable, comme dans l'étude de collaboration préalable. Pour ce qui est des échantillons appariés, les deux méthodes (alternative et de référence) sont effectuées sur les mêmes échantillons. Pour les échantillons non appariés, le laboratoire doit utiliser une portion du bouillon d'enrichissement de la méthode alternative pour la méthode de référence, et ce, aux toutes premières étapes. Il n'est pas nécessaire de préparer un autre ensemble d'échantillons à analyser par la méthode de référence.

2.5 Analyse de l'échantillon - détermination du NPP

La détermination du NPP est effectuée uniquement à l'aide de la méthode de référence sur trois portions de 50 grammes. Le laboratoire doit diluer les échantillons dans le bouillon d'enrichissement initial, en rajustant le volume pour la taille augmentée de l'échantillon (p. ex. pour une dilution 1:10, utiliser 450 ml de bouillon, pour atteindre un volume final de 500 ml). Homogénéiser soigneusement les échantillons. Transférer 10 % du volume résultant (p. ex. 50 ml) dans de nouveaux sacs Stomacher. Remplacer le volume retiré par un volume égal de bouillon frais. Remplacer également le volume transféré pour obtenir le volume initial précisé dans la méthode de référence (p. ex. ajouter 200 ml pour obtenir un volume final de 250 ml pour une méthode de référence qui demande une dilution 1:10 des portions analytiques de 25 grammes). Effectuer cette dilution une deuxième fois. Analyser le contenu de chaque sac selon la procédure de la méthode de référence. Cela produit une dilution par trois du NPP, c.-à-d. 45 grammes, 4,5 grammes et 0,50 gramme par analyse.

2.6 Résultats

Dénombrer le nombre de résultats positifs à chaque niveau de dilution pour les échantillons NPP. Calculer les valeurs NPP et les limites de confiance supérieures et inférieures de 95 % associées (voir le tableau 1). Des nombres ainsi obtenus, extrapoler la concentration des dilutions les plus faibles, en fonction du facteur de dilution de l'inoculum.

Calculer le nombre de positifs confirmés pour chaque niveau d'inoculation.  La LD se situe entre les deux niveaux d'inoculation qui produisent respectivement une récupération de positifs inférieure et supérieure à 50 % (3/6).

Tableau 1. Valeurs NPP

Nombre de résultats positifs dans une série			Résultats
45 g par analyse	4,5 g par analyse	0,5 g par analyse	NPP/25g	LCI	LCS
0	0	0	<0,168	0,021	1,35
0	0	1	0,168	0,021	1,35
0	0	2	0,325	0,068	1,65
0	0	3	0,500	0,125	2,05
0	1	0	0,170	0,021	1,38
0	1	1	0,350	0,070	1,65
0	1	2	0,500	0,125	2,05
0	1	3	0,675	0,185	2,50
0	2	0	0,350	0,070	1,68
0	2	1	0,525	0,128	2,08
0	2	2	0,700	0,188	2,50
0	2	3	0,875	0,245	3,00
0	3	0	0,525	0,130	2,10
0	3	1	0,700	0,193	2,50
0	3	2	0,875	0,250	3,00
0	3	3	1,05	0,300	3,75
1	0	0	0,198	0,028	1,40
1	0	1	0,400	0,090	1,80
1	0	2	0,600	0,160	2,33
1	0	3	0,825	0,233	3,00
1	1	0	0,400	0,093	1,80
1	1	1	0,625	0,165	2,35
1	1	2	0,850	0,238	3,00
1	1	3	1,05	0,300	3,75
1	2	0	0,625	0,168	2,38
1	2	1	0,850	0,243	3,00
1	2	2	1,08	0,300	3,75
1	2	3	1,33	0,375	4,50
1	3	0	0,875	0,248	3,00
1	3	1	1,10	0,325	3,75
1	3	2	1,35	0,375	4,75
1	3	3	1,60	0,450	5,75
2	0	0	0,500	0,125	2,05
2	0	1	0,800	0,223	2,75
2	0	2	1,10	0,325	3,75
2	0	3	1,33	0,400	5,00
2	1	0	0,825	0,230	3,00
2	1	1	1,13	0,325	4,00
2	1	2	1,48	0,425	5,25
2	1	3	1,88	0,500	7,00
2	2	0	1,18	0,325	4,00
2	2	1	1,53	0,425	5,50
2	2	2	1,93	0,500	7,25
2	2	3	2,35	0,575	9,50
2	3	0	1,58	0,450	5,75
2	3	1	2,00	0,525	7,75
2	3	2	2,45	0,600	10,0
2	3	3	3,00	0,675	12,5
3	0	0	1,28	0,375	4,50
3	0	1	2,13	0,550	8,50
3	0	2	3,50	0,800	15,3
3	0	3	5,25	1,33	21,0
3	1	0	2,35	0,575	9,50
3	1	1	4,00	0,975	17,5
3	1	2	6,25	1,70	23,8
3	1	3	8,75	2,50	30,0
3	2	0	5,00	1,28	20,5
3	2	1	8,25	2,30	30,0
3	2	2	11,8	3,50	40,0
3	2	3	16,0	4,50	57,5
3	3	0	12,8	3,75	45,0
3	3	1	24,0	5,75	100
3	3	2	55,0	13,0	235
3	3	3	>55,0	13,0	235

Figure 1A. Inoculations artificielles pour la détermination de la LD. Inoculer de trois à cinq séries de six répétitions de portions analytiques de 25 grammes avec des concentrations de cellules ciblées à environ la LD escomptée. Inoculer une autre série de six répétitions au niveau d'inoculum le plus élevé, et combiner ces portions en groupes de deux afin de générer trois portions de 50 grammes. Ces dernières sont utilisées pour déterminer le NPP des concentrations des cellules ciblées, après équilibration.

Figure 1.B Graphique d'acheminement expérimental. Inoculer de trois à cinq séries de six répétitions de portions analytiques de 25 grammes avec des concentrations de cellules ciblées à environ la LD escomptée. Inoculer une autre série de six répétitions au niveau d'inoculum le plus élevé, et combiner ces portions en groupes de deux afin de générer trois portions de 50 grammes. Ces dernières sont utilisées pour déterminer le NPP des concentrations des cellules ciblées, après équilibration.