Examen microbiologique de la crème glacée et du lait glacé

Direction générale de la protection de la santé - Ottawa

Méthode officielle MFO-2
le 30 novembre 1981

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1. APPLICATION

La présente méthode s'applique à la détermination des bactéries (numération des colonies aérobies) et des organismes coliformes dans la crème glacée et dans le lait glacé conformément au sous-alinéa d) des Articles B.08.062 et B.08.072 des Règlements sur les aliments et drogues.

2. ÉCHANTILLONNAGE

2.1 Définition des termes

2.1.1 Lot: Une quantité finie ou une unité de production qui peut être identifiée par le même code. S'il n'y a pas d'identification par code, un lot peut être considéré comme étant (a) la quantité de produit, fabriquée essentiellement sous des conditions identiques au même établissement et ne représentant pas plus que la production d'une journée; ou (b) la quantité de la même sorte et de la même saveur de produit, fabriquée par un seul et même manufacturier, qui est disponible lors de l'échantillonnage à un endroit donné.

2.1.2 Échantillon: Les unités d'échantillonnage (sous-échantillons) prélevées par lot pour analyse.

2.1.3 Unité d'échantillonnage: Il s'agit ordinairement d'un format courant de produit renfermant au moins 100 g ou ml. Une unité d'échantillonnage est souvent désignée sous le nom de souséchantillon.

2.1.4 Unité d'analyse: La quantité de crème glacée prélevée de l'unité d'échantillonnage pour analyse.

2.2 Prélèvement des échantillons

2.2.1 Prendre un échantillon composé de cinq unités d'échantillonnage prélevées au hasard sur chaque lot.

2.2.2 Chaque unité d'échantillonnage doit renfermer au moins 100 g.

2.2.3 Prélever à partir de contenants intacts lorsque possible.

2.2.4 Il est permis de prélever plus d'une unité d'échantillonnage sur de gros contenants commerciaux ou sur des contenants en vrac lorsque le nombre total d'unités d'échantillonnage requis excède le nombre de contenants du lot. Lorsque le lot comprend des contenants renfermant moins de 100 g, l'unité d'échantillonnage doit se composer de plus d'un contenant (par exemple, quatre contenants de 25 g pour chaque unité d'échantillonnage).

2.2.5 Utiliser des techniques aseptiques pour prélever les unités d'échantillonnage lorsque la crème glacée est en vrac. Déposer chacune des unités d'échantillonnage prélevées dans un contenant stérile distinct.

2.2.6 Garder les unités d'échantillonnage congelées au cours du transport.

3. MODE OPÉRATOIRE

Chaque unité d'échantillonnage doit être analysée individuellement. Il faut effectuer l'épreuve conformément aux instructions suivantes:

3.1 Manipulation des unités d'échantillonnage

3.1.1 Garder les unités d'échantillonnage congelées dans le laboratoire avant de les analyser.

3.1.2 Analyser les unités d'échantillonnage aussitôt que possible après leur arrivée au laboratoire.

3.2 Préparation des milieux

Utiliser les milieux suivants après les avoir préparés et stérilisés selon les instructions du fabricant.

3.2.1 Gélose à numération (PC)

3.2.2 Bouillon de lauryl-sulfate-tryptose (LST)

3.2.3 Bouillon lactosé au vert brillant et sels biliaires 2% (BGLB)

3.3 Préparation des dilutions

3.3.1 Préparer un diluant stérile à 0,1% d'eau peptonée.

3.3.2 Pour obtenir une unité d'analyse de 11(10)g* qui soit représentative, combiner les portions prélevées à différents endroits de l'unité d'échantillonnage congelée.

3.3.3 Préparer une dilution à 1:10 de crème glacée ou de lait glacé en ajoutant aseptiquement l'unité d'analyse à 99(90)* ml de diluant d'eau peptonée.

* Le poids et le volume inscrits entre parenthèses indiquent l'autre quantité possible pour préparer les dilutions.

3.3.4 Mélanger la dilution à 1:10 en agitant la bouteille de dilution 25 fois selon un arc de 30 cm pendant environ 7 secondes.

3.3.5 Vérifier le pH de la suspension. Si le pH ne se situe pas entre 5,5 et 7,6 l'ajuster à 7,0 avec du NaOH ou du HCl stériles.

3.3.6 Préparer les dilutions successives requises pour déterminer le nombre de bactéries coliformes présentes dans la crème glacée ou le lait glacé en transférant 11(10)* ml de la dilution précédente dans 99(90) ml * de diluant d'eau peptonée à 0,1%. Agiter toutes les dilutions (comme à l'étape (3.3.4) ci-dessus) immédiatement avant les transferts afin d'assurer une distribution uniforme des microorganismes présents.

3.4 Numération des colonies aérobies (ACC)

Le milieu utilisé est la gélose à numération préparée pour les boîtes de gélose coulée.

3.4.1 Analyse

a. Agiter chaque bouteille de dilution pour remettre le produit en suspension.

b. À l'aide d'une pipette stérile, transférer sans tarder 1 ml de chaque dilution préparée dans chacune de deux boîtes de Pétri bien marquées.

c. Verser 12-15 ml de gélose refroidie à 40-45 °C dans chaque boîte et mélanger le tout par rotation ou en inclinant les boîtes.

d. Laisser la gélose se solidifier.

e. Ne pas verser la gélose dans les boîtes plus de 15 min après la préparation des dilutions.

f. Incuber les boîtes de gélose à l'envers à 35 °C + 0,5 ^o pendant 48 + 2 h.

g. Éviter l'empilement ou l'entassement des boîtes de gélose pour leur permettre d'atteindre rapidement la température de l'incubateur.

h. Compter les colonies le plus tôt possible après la période d'incubation.

i. Choisir les boîtes de gélose qui donnent de 30 à 300 colonies, y compris les colonies minuscules. Si le nombre de colonies ne se situe pas dans ces limites, choisir les boîtes qui contiennent le nombre de colonies s'en rapprochant le plus.

3.4.2 Inscription des résultats

a. Calculer le dénombrement moyen (moyenne arithmétique) des boîtes en double en suivant les exemples du Tableau 5-1: Standard Methods for the Examination of Dairy Products, A.P.H.A., 14 ^e édition (E.H. Marth, Éditeur, 1978).

b. Pour les résultats finals, arrondir les dénombrements à deux chiffres significatifs et inscrire seulement les deux premiers chiffres de gauche (par exemple, inscrire 2 850 comme étant 2 900).

c. Si la dilution la plus faible qui a été ensemencée ne présente pas de colonies, inscrire la numération comme étant le produit de 0,5 X le facteur de dilution précédé d'un signe "plus petit que"(<).

d. Utiliser la formule suivante pour calculer la numération des colonies aérobies (ACC):

N=AxD, N étant le nombre de colonies par g de produit, A le dénombrement moyen et D le facteur de dilution respectif.

3.5 Détermination des coliformes

3.5.1 Épreuve de présomption

a. Le milieu utilisé est un bouillon de lauryl-sulfate-tryptose (LST) réparti en volumes de 10 ml dans des éprouvettes contenant des ampoules à gaz (éprouvettes de Durham renversées). .

b. Disposer les éprouvettes de bouillon LST en rangées de cinq et les marquer en identifiant l'échantillon, l'unité d'échantillonnage et la dilution à ensemencer.

c. Ensemencer chaque éprouvette d'un ensemble de cinq éprouvettes renfermant du bouillon LST à teneur simple, avec 1 ml de la dilution à 1:10 (homogénat de la crème glacée ou du lait glacé; voir la section 3.3 ci-dessus). Répéter pour chaque dilution décimale successive requise.

d. Mélanger délicatement l'inoculum et le milieu par agitation ou par rotation, mais éviter que de l'air ne reste emprisonné dans les ampoules à gaz.

e. Incuber les éprouvettes ensemencées de bouillon LST à 35 °C + 0,5 ^o pendant 24 + 2 h. Examiner s'il y a eu production de gaz, inscrire les résultats et, le même jour, commencer l'épreuve de confirmation pour toutes les éprouvettes positives (contenant du gaz) (voir la section 3.5.2 ci-dessous).

f. Incuber les éprouvettes négatives pendant 24 + 2 h supplémentaires, examiner, inscrire le nombre d'éprouvettes positives, l'ajouter aux résultats obtenus à l'étape e, ci-dessus et commencer l'épreuve de confirmation pour les éprouvettes positives supplémentaires.

g. S'il n'y a pas eu formation de gaz après 48 + 2 h, l'épreuve de présomption est négative. h. Calculer le "NPP" de coliformes présumés par g de crème glacée ou de lait glacé, en suivant les instructions données dans la partie 5, pour convertir le nombre d'éprouvettes positives (contenant du gaz) en NPP. Inscrire les résultats.

3.5.2 Épreuve de confirmation

a. Le milieu utilisé pour l'épreuve de confirmation est le bouillon BGLB, réparti en volumes de 10 ml dans des éprouvettes contenant des ampoules à gaz.

b. Soumettre toutes les éprouvettes positives (contenant du gaz) à l'épreuve de confirmation.

c. Mélanger le contenu des éprouvettes de bouillon LST, positives par agitation ou par rotation, et ensemencer à l'aide d'un fil bouclé du contenu de chaque éprouvette de bouillon LST positive dans une éprouvette distincte de bouillon BGLB. (Éviter d'entraîner la pellicule.)

d. Mélanger délicatement l'inoculum et le milieu par agitation ou par rotation mais éviter que de l'air ne reste emprisonné dans les ampoules à gaz.

e. Incuber les éprouvettes de bouillon BGLB ensemencées à 35 °C + 0,5 ^o pendant 24 + 2 h. Examiner s'il y a eu production de gaz et inscrire les résultats.

f. Incuber les éprouvettes négatives pendant 24 + 2 h supplémentaires, examiner, inscrire le nombre d'éprouvettes positives supplémentaires (contenant du gaz) et l'ajouter aux résultats obtenus à l'étape e, ci-dessus.

g. S'il y a eu production de gaz dans les 48 + 2 h, l'épreuve de confirmation est positive.

h. Calculer le "NPP" de coliformes confirmés par g de crème glacée ou de lait glacé en suivant les instructions données dans la partie 5, pour convertir le nombre d'éprouvettes positives (contenant du gaz) en valeurs NPP. Inscrire les résultats.

4. INTERPRÉTATION

Les limites tolérées telles que spécifiées ci-après, représentant le dénombrement maximal de colonies aérobies (numération des colonies aérobies) et le taux probable maximal d'organismes coliformes dans la crème glacée ou le lait glacé, doivent être utilisées pour déterminer si le lot de produit examiné est conforme à l'Article B.08.062 d) ou B.08.072

d) des Règlements sur les aliments et drogues.

4.1 Le dénombrement maximal de bactéries aérobies permis pour chaque lot est représenté par une numération de colonies aérobies ne dépassant pas:

4.1.1 100 000 par g dans plus de deux des cinq unités d'échantillon-nage, et

4.1.2 1 000 000 par g dans n'importe quelle des cinq unités d'échan-tillonnage comprises dans l'échantillon prélevé sur un lot.

4.2 Le nombre le plus probable maximal d'organismes coliformes permis pour chaque lot est représenté par un NPP de coliformes n'excédant pas:

4.2.1 10 par g dans plus d'une des cinq unités d'échantillonnage, et

4.2.2 1 000 par g dans n'importe quelle des cinq unités d'échantil-lonnage, comprises dans l'échantillon prélevé sur un lot. Les limites tolérées sont résumées dans le Tableau qui suit:

5. CALCUL DES NOMBRES LES PLUS PROBABLES (NPP)

Le Tableau A-1 présente les nombres de coliformes les plus probables par 100 g ou ml de produit à l'essai correspondant au nombre d'éprouvettes positives (contenant du gaz) dans l'épreuve des coliformes. Le Tableau A-1 a été adapté à partir d'une table de conversion préparée pour l'analyse de l'eau potable où seulement 10, 1,0 ou 0,1 ml de l'eau examinée sont utilisés comme portions. Il serait également approprié que 10, 1,0 et 0,1 g de nourriture solide constituent les portions dans les éprouvettes. Lorsque des portions différentes du produit à l'essai sont placées dans les éprouvettes, les valeurs du NPP obtenues dans le Tableau A-1 doivent alors être rectifiées en les multipliant par un nombre approprié selon la quantité réelle de produit à l'essai dans les éprouvettes et selon que l'on veut obtenir le NPP par g (ml) comme on le fait habituellement pour les aliments plutôt que par 100 ml (g) comme dans le Tableau. On ne tient pas compte du volume de diluant ajouté aux éprouvettes (et accompagnant l'échantillon) lorsqu'on calcule le NPP.

Exemple:

Les éprouvettes ensemencées donnent les résultats suivants:

Détermination	n	c	m	M
ACC	5	2	100 000	1 000 000
Coliforms	5	1	10	1 000

n	=	Nombre d'unités d'échantillonnage (sous-échantillons) qu'il faut examiner par lot.
c	=	Nombre maximal d'unités d'échantillonnage (sous-échantillons) par lot qui peuvent avoir une concentration bactérienne supérieure à la valeur prévue sous "m" sans enfreindre les Règlements.
m	=	Nombre maximal de bactéries par g de crème glacée ou de lait glacé qui ne présente aucun danger (niveau tolérable de contamination)
M	=	Nombre maximal de bactéries par g de crème glacée ou de lait glacé qui, s'il est dépassé par une unité d'échantillonnage (sous-échantillon) quelconque rend le lot examiné non conforme aux Règlements.

(1) 5 éprouvettes et 10 ml d'une dilution à 1:10 du produit à l'essai - toutes les 5 sont positives

(2) 5 éprouvettes et 1 ml d'une dilution à 1:10 du produit à l'essai - 1 positive

(3) 5 éprouvettes et 1 ml d'une dilution à 1:100 du produit à l'essai - aucune positive. Les quantités d'échantillon dans chacune des 5 éprouvettes des 3 séries de dilutions représentent respectivement 1, 0,1 et 0,01 g ou ml de produit à l'essai.

Si l'on se reporte au Tableau A-1, une lecture de 5-1-0 donne une valeur de 33 si on utilise 10, 1 et 0,1 g ou ml respectivement. Toutefois, comme seulement 1/10 de ces quantités a été en fait utilisé dans l'analyse, la valeur 33 obtenue en consultant le Tableau A-1 doit être multipliée par 10, ce qui donne 33 x 10 = 330 micro- organismes par 100 g ou ml de produit à l'essai. Comme les résultats doivent être exprimés par g ou ml, le NPP doit être divisé par 100. Lorsqu'on se sert de dilutions plus élevées, on suit la même méthode mais on augmente le multiplicateur (facteur de dilution) pour relier la quantité de produit à l'essai réellement présente aux valeurs fondées sur les quantités de 10, 1 et 0,1 g ou ml qu'indique le Tableau A-1. Facteur de dilution = Inverse de la dilution de l'unité d'analyse. Pour calculer le NPP, utiliser le facteur de dilution de la série médiane des trois dilutions choisies.

Afin de déterminer quelles dilutions consécutives doivent être utilisées, se reporter aux combinaisons indiquées ci-après: (Voir également le Tableau A-2)

1. Si l'on fait seulement 3 dilutions, utiliser les résultats des 3 dilutions pour calculer le NPP.

Exemples a et b.

2. Si l'on a fait plus de 3 dilutions, utiliser les résultats des 3 dilutions successives. Choisir la plus élevée à laquelle toutes les cinq éprouvettes sont positives et les 2 dilutions successives supérieures. Exemples c et d.

3. Lorsqu'on a fait plus de dilutions, dont aucune ne donne 5 éprouvettes positives, utiliser les 3 premières dilutions. Exemple e.

4. Si la dilution supérieure aux 3 dilutions devant être choisies est positive, le nombre d'éprouvettes positives doit être ajouté à celui de la dilution voisine la moins élevée. Exemple f.

5. Si les éprouvettes de tous les ensembles d'une série de dilution sont positives, choisir les 3 dilutions supérieures de la série et se servir du symbole > (plus grand que) pour indiquer que le NPP est plus grand que celui qui a été calculé. Exemple g. Consulter le Tableau A-1 et chercher la valeur correspondant au nombre d'éprouvettes positives obtenues.

NPP/g (ml) = nombre de microorganismes (Tableau A-1)/100 x facteur de dilution de l'ensemble intermédiaire.

Tableau A-1

Nombre le plus probable (NPP) de bactéries par 100 g (ml) de produit à l'essai en utilisant 5 éprouvettes contenant 10, 1 et 0,1 ml ou g de produit à l'essai

Pos* 10;1;0,1	NPP	Pos* 10;1;0,1	NPP	Pos* 10;1;0,1	NPP	Pos* 10;1;0,1	NPP	Pos* 10;1;0,1	NPP	Pos* 10;1;0,1	NPP
0	<1.8	100	2	200	4.5	300	7.8	400	13	500	23
001	1.8	101	4	201	6.8	301	11	401	17	501	31
002	3.6	102	6	202	9.1	302	13	402	21	502	43
003	5.4	103	8	203	12	303	16	403	25	503	58
004	7.2	104	10	204	14	304	20	404	30	504	76
005	9	105	12	205	16	305	23	405	36	505	95
010	1.8	110	4	210	6.8	310	11	410	17	510	33
011	3.6	111	6.1	211	9.2	311	14	411	21	511	46
012	5.5	112	8.1	212	12	312	17	412	26	512	64
013	7.3	113	10	213	14	313	20	413	31	513	84
014	9.1	114	12	214	17	314	23	414	36	514	110
015	11	115	14	215	19	315	27	415	42	515	130
020	3.7	120	6.1	220	9.3	320	14	420	22	520	49
021	5.5	121	8.2	221	12	321	17	421	26	521	70
022	7.4	122	10	222	14	322	20	422	32	522	95
023	9.2	123	12	223	17	323	24	423	38	523	120
024	11	124	15	224	19	324	27	424	44	524	150
025	13	125	17	225	22	325	31	425	50	525	180
030	5.6	130	8.3	230	12	330	17	430	27	530	79
031	7.4	131	10	231	14	331	21	431	33	531	110
032	9.3	132	13	232	17	332	24	432	39	532	140
033	11	133	15	233	20	333	28	433	45	533	180
034	13	134	17	234	22	334	31	434	52	534	210
035	15	135	19	235	25	335	35	435	59	535	250
040	7.5	140	11	240	15	340	21	440	34	540	130
041	9.4	141	13	241	17	341	24	441	40	541	170
042	11	142	15	242	20	342	28	442	47	542	220
043	13	143	17	243	23	343	32	443	54	543	280
044	15	144	19	244	25	344	36	444	62	544	350
045	17	145	22	245	28	345	40	445	69	545	440
050	9.4	150	13	250	17	350	25	450	41	550	240
051	11	151	15	251	20	351	29	451	48	551	350
052	13	152	17	252	17	352	32	452	56	552	540
053	15	153	19	253	26	353	37	453	64	553	920
054	17	154	22	254	29	354	41	454	72	554	1600
055	19	155	24	255	32	355	45	455	81	555	>1600

* Nombre d'éprouvettes positives avec chacun des 3 volumes ou poids utilisés.

Tableau A-2

Dilutions à employer et calcul du NPP par g ou ml de produit à l'essai

	Dilutions*					Combinaison à utiliser	NPP du Tableau A-1	Facteur de dilution de l'ensemble intermédiaire	NPP par g ou ml
	Non dilué		1:10	1:100	1:1000
	Quantité réelle de produit à l'essai (g ou ml)
	10	1	0,1	0,01	0,001
a.	5/5**	5/5	2/5			5-5-2	540	1	5.4
b.		5/5	5/5	2/5		5-5-2	540	10	54
c.		5/5	5/5	2/5	2/5	5-2-2	95	100	95
d.		5/5	5/5	2/5	0/5	5-2-0	49	100	49
e.		2/5	2/5	1/5	0/5	2-2-1	12	10	1.2
f.		5/5	2/5	1/5	1/5***	5-2-2	95	10	9.5
g.		5/5	5/5	5/5	5/5	5-5-5	>1600	100	>1600

* Les dilutions à employer sont soulignées.

** Nombre d'éprouvettes positives/nombre d'éprouvettes ensemencées.

*** Voir page 6, numéro 4.