Lignes directrices sur la technologie de la PCR
juillet 2006

Lignes directrices du bureau des dangers microbiens quant à l'utilisation de la technologie de la PCR pour la détection des pathogènes bactériens d'origine alimentaire

Sommaire de méthodes
Janvier 2005

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1. Portée :

1.1. Ces lignes directrices s'appliquent à l'utilisation de la technologie de la PCR dans deux situations distinctes :

1. pendant la « détection » d'agents pathogènes dans les bouillons d'enrichissement ou les colonies purifiées (section 3.1), et
2. pendant l'identification de pathogènes d'origine alimentaire purifiés dans des agars bactériologiques (sections 3.2 et 3.3).

Les lignes directrices ou les exposés de principe sur l'utilisation de la technologie de la PCR pour la détection de microorganismes, de parasites et de virus « viables, mais impossibles à produire par culture » seront éventuellement abordées dans un autre document.

1.2 Les méthodes fondées sur la technologie de la PCR à utiliser pour respecter les présentes lignes directrices et/ou à des fins réglementaires seront examinées au cas par cas.

2. Définitions :

2.1 Technologie de la PCR

La technologie de la PCR renvoie à l'amplification de l'acide nucléique suivie d'une caractérisation du diagnostic (p. ex. PCR en fin de réaction, PCR en temps réel, PCR multiplex, PCR utilisant la transcriptase inverse, NASBA, etc.).

2.2 Compendium de méthodes

Le Compendium de méthodes renvoie à toute méthode standard et validée publiée dans le Compendium de méthodes analytiques, et est disponible sur le site Web de la Direction des aliments (Santé Canada) à l'adresse : http://www.hc-sc.gc.ca/fn-an/res-rech/analy-meth/microbio/index-eng.php

MFLP ou procédure de laboratoire dans le volume 3.
Une procédure de laboratoire est définie comme une méthode non validée par une étude interlaboratoire ou ne répondant pas aux attributs et aux caractéristiques d'une méthode de la DGPS.

MFHPB ou méthode de la DGPS dans le volume 2.
Une méthode MFHPB est définie comme une méthode qui a été validée par une étude interlaboratoire comparative ou une étude en collaboration.

Consulter le document intitulé Procédure d'élaboration et de gestion de méthodes microbiologiques dans les aliments du volume 1 du Compendium pour de plus amples renseignements sur ces méthodes.

3. Applications de la technologie de la PCR :

Conditions préalables : L'essai biologique de la PCR a été validé par des études d'évaluation pour son application proposée et doit au minimum posséder les caractéristiques des procédures de laboratoire (MFLP) du Compendium.

3.1. Détection d'un microorganisme ciblé :

La PCR pourrait être utilisée comme test de détection d'un microorganisme ciblé :

1. dans les bouillons de pré-enrichissement et/ou les bouillons d'enrichissement sélectifs avant la culture sur gélose sélective ou différentielle; ou
2. sur les colonies isolées dans un milieu sélectif avant l'exécution des essais biochimiques.

Cette approche pourrait permettre la détection rapide d'un grand nombre de colonies et de bouillons suspects en cas de contrainte de temps et de questions relatives à la santé comme dans le cas de poussée d'origine alimentaire et de questions complexes de conformité et commerciales). Tous les échantillons positifs présumés d'après la PCR doivent être confirmés à l'aide d'une méthode de confirmation validée dans le Compendium ou d'un équivalent1, tel que précisé dans la méthode de la PCR.

Nota : Lorsque la PCR indique qu'un bouillon est positif et que la bactérie viable ciblée NE PEUT être isolée sur une gélose sélective, l'analyste doit suivre les procédures recommandées, tel que précisé dans la méthode de la confirmation ou de la PCR.

3.2. Remplacement des trousses d'identification rapide par la technologie de la PCR

Lorsqu'une méthode utilisant la technologie de la PCR est approuvée par le Comité des méthodes microbiologiques (CMM) (en collaboration avec SC et l'ACIA, au besoin) à cette fin, un nombre minimal d'essais biochimiques sont nécessaires à la confirmation, tel que précisé dans la méthode.

Cela dépend du nombre et de la spécificité des amorces utilisées dans la méthode, la circonstance (test de routine, activité de conformité, ou enquête relative à une poussée d'origine alimentaire), le micro-organisme ciblé et le type d'activité de conformité exécutée.

Les tests de confirmation supplémentaires doivent être précisés dans chaque méthode de la PCR.

3.3. Confirmation d'un microorganisme ciblé :

Si, pendant l'application d'une méthode du Compendium ou d'un équivalent¹ (étapes d'enrichissements et de culture sur gélose sélective), on retrouve des colonies que l'on présume positives dans les géloses sélectives, la technologie de la PCR ne suffit pas à identifier le micro-organisme ciblé, sauf sur approbation contraire (section 3.4).

Lorsqu'une méthode utilisant la technologie de la PCR est approuvée par le CMM (en collaboration avec SC et l'ACIA, au besoin), un nombre minimal d'essais biochimiques sont nécessaires pour confirmer l'identification du microorganisme, tel que précisé dans la méthode de la PCR.

Les facteurs déterminant le type et le nombre de tests biochimiques supplémentaires dépendront du nombre et de la spécificité des amorces utilisées dans la méthode, la circonstance (test de routine, activité de conformité, ou enquête relative à une poussée d'origine alimentaire), le micro-organisme ciblé et le type d'activité de conformité exécutée proposé. Les étapes de confirmation supplémentaires doivent être précisées dans chaque méthode de la PCR.

3.4. Technologie de la PCR à titre de seule étape de confirmation

Conditions préalables : L'essai biologique de la PCR a été validé par des études d'évaluation, y compris des études comparatives et/ou en collaboration, pour obtenir le statut de méthode de la DGPS (MFHPB) pour son application proposée dans le Compendium.

3.4.1 Exemples :

1. Lorsqu'une méthode de la PCR répond à tous les critères établis par le CMM (en collaboration avec SC et l'ACIA, au besoin), alors la méthode fondée sur la PCR peut être utilisée à titre de seule étape de confirmation des tests d'identification de colonies présumées de géloses sélectives ou non sélectives.
2. Une méthode de la PCR peut être utilisée à titre provisoire lorsqu'il s'agit de la seule étape de confirmation disponible d'un micro-organisme ciblé. NOTA : Dans cette situation, la méthode peut n'avoir que le statut de procédure de laboratoire MFLP. Lorsqu'une ou des maladies se développent, et qu'une nouvelle bactérie pathogène émergente est soupçonnée, ce statut peut ne pas être nécessaire.

Cela dépend du nombre et de la spécificité des amorces utilisées dans la méthode, la circonstance (test de routine, activité de conformité, ou enquête relative à une poussée d'origine alimentaire), le microorganisme ciblé et le type d'activité de conformité exécutée ainsi que la quantité de données fournies par le CMM (en collaboration avec SC et l'ACIA, au besoin).

4. Pour de plus amples renseignements :

4.1. Il faut utiliser les témoins internes de la PCR pour chaque réaction d'amplification pour qu'il n'y ait aucune interférence au cours du processus.

4.2 Une orientation en matière d'interprétation doit être fournie pour chaque méthode. Les résultats prévus doivent être inclus dans la section sur l'interprétation de chaque méthode.

1. Les « méthodes équivalentes » sont définies dans le document sur l'élaboration des méthodes. Il revient au laboratoire de démontrer qu'une autre méthode est équivalente aux procédures de laboratoire de SC ou aux méthodes de la DGPS.