Détermination de la stérilitécommerciale et de la présence de microorganismes viables dans les aliments en conserve

Mars 2001
Méthode de la DGPS MFHPB-01

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1. APPLICATION

Cette méthode s'applique à la détection des microorganismes viables dans des aliments commercialement stériles emballés dans des contenants scellés hermétiquement afin de déterminer s'il y a conformité avec les exigences de la division 27 et des articles 4 et 7 de la Loi sur les aliments et drogues, ainsi qu'avec les articles pertinents de la Loi sur les produits agricoles, de la Loi sur l'inspection des viandes et de la Loi sur l'inspection du poisson. Cette méthode remplace la méthode MFHPB-25C datée de mars 1989.

2. PRINCIPE

Cette méthode est fondée sur l'échantillonnage aseptique d'aliments scellés hermétiquement et sur l'ensemencement subséquent de milieux appropriés dans le but de déterminer la présence ou l'absence de microorganismes viables.

Une portion du produit est mélangée avec des milieux spécifiques et incubée à une température donnée pendant une période précise. On suppose que, dans ces conditions, chaque microorganisme viable se multipliera et produira une colonie visible dans les milieux solides ou une turbidité dans les milieux liquides

Cette méthode sert aussi à caractériser ces microorganismes selon les critères suivants:

• leur présence en populations mixtes ou pures ;
• leur besoin en oxygène : anaérobie, aérobie ou facultatif ;
• leur nature mésophile ou thermophile ;
• leur forme: coques , bacilles ou spirales.

3. DÉFINITIONS DES TERMES

3.1 Voir l'Annexe A du volume 2.

3.2 Stérilité commerciale : condition obtenue par chauffage, seul ou combiné à d'autres traitements, pour éliminer les microorganismes viables, y compris les spores, capables de croître dans les aliments aux températures normales de distribution et d'entreposage de ces aliments. Si la température normale d'entreposage ou de manipulation du produit est supérieure à 40 C, il faut alors analyser pour les microorganismes thermophiles. Sinon, analyser pour les microorganismes mésophiles seulement.

Cette définition ne s'applique pas aux aliments peu acides qui sont gardés réfrigérés ou congelés et étiquetés comme tels, ni aux produits de la tomate dont le pH est de 4,7 ou moins après traitement à la chaleur.

3.3 Contenants scellés hermétiquement : contenants conçus pour empêcher la pénétration de microorganismes, y compris les spores. Il peut s'agir de boîtes en métal, de pots en verre, d'emballages flexibles comme les sachets autoclavables et les Tetrapaks, etc.

3.4 Aliment peu acide : aliment autre qu'une boisson alcoolisée dont n'importe quel élément constituant a un pH de plus de 4.6 et une activité hydrique de plus de 0.85.

3.5 Aliment acide et acidifié : aliment dont le pH est de 4.6 ou moins.

3.6 Activité hydrique : ratio de la tension de vapeur d'un aliment sur la tension de vapeur de l'eau pure à la même température et à la même pression.

3.7 Réfrigération : exposition à une température de 4°C ou moins sans qu'il y ait congélation.

3.8 Produits semi-liquides : produits difficiles à verser mais qu'il est possible de mélanger en agitant le contenant avant de l'ouvrir. Avant d'ouvrir les contenants de produits liquides, il faut bien en mélanger le contenu.

3.9 Produits semi-solides : produits à viscosité élevée, très difficiles à verser et impossibles à mélanger en agitant le contenant fermé.

4. PRÉLÈVEMENT DES ÉCHANTILLONS

4.1 Voir l'Annexe B du volume 2.

4.2 Pendant l'entreposage et le transport de contenants ouverts, bombés ou qui fuient, et d'échantillons qu'on soupçonne d'être liés à une intoxication alimentaire, il faut contenir les unités d'échantillonnage comme il se doit (c.-à-d. dans des sacs en plastique scellables déposés dans des bacs en métal ou en plastique hermétiques) et les réfrigérer. Il faut transférer de façon aseptique dans des contenants stériles le contenu des contenants ouverts, chaque fois que c'est possible.

4.3 Produits transformés et emballés de façon aseptique : Il faut soumettre tout contenant prélevé moins de 30 jours après le conditionnement à une pré-incubation de 7 jours à 30-35 °C avant de procéder à l'analyse. Il se peut toutefois qu'on ne puisse appliquer cette procédure dans des situations comme les enquêtes sur une maladie ou un manque évident de stérilité commerciale.

5. MATÉRIEL ET ÉQUIPEMENTS SPÉCIAUX

1. Hotte à écoulement d'air laminaire ou enceinte de biosécurité, située dans une salle propre.
   
   Effectuer toutes les analyses microbiologiques sous une hotte à écoulement d'air laminaire. Le dénombrement des particules dans l'écoulement d'air laminaire ne doit pas excéder 100 particules de 0,5 micron ou plus par pied cube (classe 100, U.S. Federal Standard 209B). Une salle propre de classe 10 000 est acceptable dans les conditions indiquées au point 8.1.3. L'utilisation d'une salle propre de classe 100 000 s'est également avérée satisfaisante, si les mesures supplémentaires d'assurance de la qualité précisées au point 8.1.3 sont respectées.
2. Sarraus, bonnets, gants et masques stériles, ou l'équivalent. Les masques faciaux sont facultatifs.
   
   Vêtements de protection minimaux acceptables : sarraus propres avec manches de protection et poignets bien ajustés ; gants chirurgicaux ; bonnet ; masque recouvrant la bouche, le nez, la moustache et la barbe. Il faut se désinfecter les mains gantées au besoin.
3. Ouvre-boîte sanitaire (comme Bacti-Disc Cutters, Wilkens-Anderson Co.) ou autres dispositifs stériles pour ouvrir les contenants.
4. Éprouvettes de culture stériles munies de bouchons qui vissent (20 x 150 mm).
5. Pipettes de transfert stériles bouchées avec de la ouate (pour liquides et produits semi-liquides)
6. Cuillères, spatules, instruments de prélèvement, perce-bouchons stériles, etc (pour l'échantillonnage des produits visqueux, semi-solides et solides).
7. Anses stériles
8. Jarres anaérobies
9. Solution désinfectante telle que le chlore
10. Récipient en plastique d'une capacité de 2 à 10 litres, pour l'immersion des boîtes de conserve dans la solution désinfectante.
11. Ruban indicateur de chlore (Diversey Wyandotte) ou l'équivalent
12. Alcool à 70 % (facultatif)
13. pH mètre ou papier pH capable de distinguer de 0,3 à 0,5 unité pH dans l'échelle de pH 6,0 à 7,5
14. Contenants stériles pouvant être fermés hermétiquement, pour garder les échantillons d'aliments en vue d'analyses ultérieures
15. Solutions de coloration de Gram
16. Microscope optique
17. Cultures témoins; utiliser les cultures suivantes ou l'équivalent :
    
    sporulant mésophile anaérobie :
    Clostridium sporogenes ATCC 7955 (NFPA 3679) ou C. histolyticum
    croissance aérobie (30°C) :
    Bacillus coagulans ATCC 8038 (NFPA 43P)
    croissance de thermophile aérobie strict :
    Bacillus stearothermophilus ATCC 12016 (NFPA 2184)
    croissance de thermophile anaérobie strict (55°C):
    Clostridium thermosaccharolyticum ATCC 7956
18. Pointe de diamant ou autre dispositif à marquer
19. Plateaux d'examen stériles (plateaux à cuisson en Pyrex ou en émail).
20. Sacs en plastique stériles (pour manipuler les contenants bombés décrit en 4.1 et 7.3.2) ou dispositifs de confinement équivalents
21. Incubateurs, 30, 35 à 55EC
22. Bains-marie, 80°C, 100°C

Note : Il incombe à chaque laboratoire d'assurer que la température des incubateurs ou bains-marie demeure au niveau recommandé. Lorsqu'on recommande 35 C dans le texte de la méthode, l'incubateur peut être réglé à 35 +/-1,0 C. De même, une température plus basse de 30 ou 25 degrés peut être à +/-1,0 C. Lorsqu'on recommande des températures plus élevées, comme 43 ou 45,5 C, il est toutefois impératif de maintenir les incubateurs ou les bains-marie à la température indiquée +/-0,5 C parce que les températures plus élevées peuvent être létales pour les micro-organismes qu'on cherche à isoler.

23. Milieux et réactifs

Note : La plupart des milieux suivants sont disponibles sur le marché et ils doivent être préparés et stérilisés selon les instructions du fabricant.

ALIMENTS PEU ACIDES

Note : Pour le lait et les produits laitiers de longue conservation : afin d'aider à la récupération des micro-organismes, ajouter 1 ml de produit restérilisé à chaque litre de milieu tempéré avant de verser dans les plaques.

Enrichissement

PE-2
Milieu de viande cuite (CMM)

Ensemencement

Gélose pour numération sur plaque (PCA)
Gélose trypticase soya (TSA)
Gélose au sang (BA)
Milieu clostridial renforcé (RCM)
Gélose au foie de veau (LVA)

Facultatif

Gélose de Baird-Parker
Gélose de MacConkey

ALIMENTS ACIDES ET ALIMENTS PEU ACIDES ACIDIFIÉS

Note : Il peut être nécessaire d'ajuster au pH de l'aliment en cause le pH des milieux de culture utilisés (bouillons et géloses) lors de l'analyse d'un aliment acide ou acidifié. Il est possible qu'il suffise de connaître la valeur du pH de l'aliment à analyser à la suite d'analyses antérieures. Toutefois, si l'on ne connaît pas le pH, il faudra déterminer le pH du contenu d'au moins une boîte.

Enrichissement

Bouillon acide (AB)

Ensemencement

Gélose pomme de terre et dextrose (PDA)
Gélose de Sabouraud au dextrose (SDA)
Gélose thermoacidurans (TA)
Gélose au sérum à l'orange (OSA); il faut de "l'adjuvant de filtration" pour la gélose OSA

6. PRÉCAUTIONS

JUSQU'À PREUVE DU CONTRAIRE, MANIPULER TOUTES LES BOÎTES BOMBÉES COMME SI ELLES CONTENAIENT DU CLOSTRIDIUM BOTULINUM OU SES TOXINES. NE JAMAIS GOÛTER AU CONTENU D'UNE BOÎTE FAISANT L'OBJET D'UNE ENQUÊTE. TOUJOURS SE SERVIR DE PIPETTES MÉCANIQUES.

LES BOÎTES BOMBÉES, TOUT PARTICULIÈREMENT LORSQU'IL S'AGIT D'UN BOMBEMENT DE TYPE PERMANENT, PEUVENT LAISSER JAILLIR LEUR CONTENU LORSQU'ELLES SONT PERFORÉES. IL CONVIENT DONC D'UTILISER LES TECHNIQUES DE MANIPULATION APPROPRIÉES AFIN D'ÉVITER TOUTE CONTAMINATION DU MILIEU ENVIRONNANT. IL EST RECOMMANDÉ DE MANIPULER LES CONTENANTS BOMBÉS DANS UNE ENCEINTE DE BIOSÉCURITÉ DE CLASSE II QUI PROTÈGE L'OPÉRATEUR ET LE PRODUIT.

SUIVRE TOUTES LES PRÉCAUTIONS ET LES MÉTHODOLOGIES D'ANALYSE QUI ONT TRAIT À C.BOTULINUM DÉCRITES DANS LA MÉTHODE MFHPB-16.

7. MARCHE À SUIVRE

Analyser chaque unité d'échantillonnage individuellement. Effectuer l'analyse en suivant les instructions ci-dessous :

7.1 Manipulation et préparation de l'unité d'échantillonnage

7.1.1 Identification de l'unité d'échantillonnage

Identifier de façon lisible chaque unité d'échantillonnage directement sur le contenant au moyen d'une pointe de diamant ou d'un autre marqueur. Faire en sorte que l'indication ne puisse disparaître au cours des manipulations et épreuves subséquentes. S'assurer que le code renvoie à l'échantillon d'où provient l'unité d'échantillonnage. Noter le code au complet pour chaque unité d'échantillonnage.

7.1.2 Enlèvement et identification de l'étiquette

Tracer des marques de correspondance sur l'étiquette et le contenant. Sur la boîte, utiliser une encre indélébile ou une plume à pointe de carbure ou de diamant pour que les marques ne disparaissent pas au cours de la manipulation subséquente du contenant. Ces marques permettront de retrouver la position de l'étiquette sur la boîte. Enlever soigneusement l'étiquette de façon à l'abîmer le moins possible (ne s'applique pas aux boîtes lithographiées).

Inscrire les numéros de l'échantillon et de l'unité d'échantillonnage sur l'étiquette.

7.2 Nettoyage et désinfection de la surface extérieure du contenant ainsi que des pièces d'équipement

Brosser au besoin les contenants au détergent et à l'eau. Préparer une quantité suffisante de solution chlorée dans un récipient assez grand pour pouvoir y immerger totalement les contenants à désinfecter. Immerger complètement ces derniers dans la solution chlorée ou recouvrir de solution l'extrémité à ouvrir pendant un temps d'immersion d'au moins 20 minutes. Vérifier régulièrement la concentration de chlore actif (libre) dans la solution. On pourra se servir, à cet effet, de papier indicateur de chlore. (La solution demeure efficace jusqu'à ce que la concentration de chlore disponible descende à moins de 100 ppm; aussitôt que la concentration de chlore tombe sous cette limite, préparer une solution fraîche.) Retirer les contenants de la solution à l'aide d'instruments stériles, par ex., pinces, gants. On peut également décontaminer la surface extérieure du contenant en la rinçant avec une solution à 2 % d'acide peracétique dans un agent mouillant approprié (par ex., polysorbitan 80 à 0,1 %) pendant 5 minutes. Prendre les précautions nécessaires pour manipuler ces désinfectants chimiques.

Après la désinfection, placer les contenants, l'extrémité à ouvrir vers le haut (habituellement l'extrémité non codée), sur une surface désinfectée au préalable située sous une hotte à écoulement d'air laminaire fonctionnant correctement. Avant de percer le contenant, veiller à ce que la surface à ouvrir soit complètement sèche. Laisser les contenants sécher sous flux d'air à écoulement laminaire ou les assécher avec des serviettes en papier stériles jetables.

7.3 Ouverture du contenant

7.3.1 Contenants normaux (non bombés)

Pour les produits liquides ou semi-liquides : bien mélanger le contenu avant de procéder à l'échantillonnage. A cette fin, inverser le contenant au moins 20 à 30 fois juste avant de l'ouvrir. Placer le contenant avec l'extrémité codée vers le bas.

Utiliser un ouvre-boîte stérile ou désinfecté pour chaque contenant. On peut utiliser un autre dispositif de perçage. Découper un trou dans l'extrémité de la boîte, à 1/4 de pouce (6,35 mm) du serti, de façon à faciliter l'échantillonnage du contenu et l'exécution de l'épreuve de détection des fuites microscopiques par la méthode du vide.

Pour désinfecter un ouvre-boîte après utilisation, lorsque l'on compte la réutiliser immédiatement, enlever toute trace de produit qui y adhère, immerger toute la pointe de l'ouvre-boîte dans une solution aqueuse d'éthanol à 70 % et passer à la flamme toute son extrémité, y compris les parties servant à percer et à couper. Laisser l'ouvre-boîte refroidir sous une hotte à écoulement d'air laminaire avant de l'utiliser de nouveau. On peut également désinfecter l'instrument en l'immergeant dans la solution désinfectante (point 7.2) pendant au moins 20 minutes. Par la suite, laisser sécher l'instrument à l'air sous une hotte à écoulement d'air laminaire ou le passer à la flamme.

7.3.2 Contenants bombés

Note : Voir les précautions à prendre au point 6.

Placer le contenant dans un sac en plastique stérile et percer le contenant en tenant fermement l'ouverture du sac autour de la tige de l'ouvre-boîte. Ne pas retirer le contenant avant que les gaz en soient complètement évacués. Cette méthode s'est avérée la meilleure pour les sachets souples bombés.

Après l'expulsion complète des gaz, utiliser un ouvre-boîte stérile pour ouvrir le contenant en découpant un trou dans son extrémité à 1/4 de pouce (6,35 mm) du serti afin de faciliter l'échantillonnage du contenu ainsi que l'exécution de l'épreuve de détection des fuites microscopiques par la méthode du vide.

7.4 Échantillonnage du contenu

Immédiatement avant d'ensemencer les milieux, transférer aseptiquement au moins 50 g de l'aliment dans un contenant stérile qui se ferme hermétiquement. Étiqueter et réfrigérer de manière à empêcher toute contamination subséquente du produit. Prélever un à deux millilitres ou grammes de produit dans le contenant afin d'ensemencer les milieux de culture liquides appropriés. Si un ensemencement direct sur plaque est effectué, étaler au moins une anse de produit (environ 0,01 ml) sur chaque milieu solide en plaque. On peut utiliser aussi la méthode de milieu coulé en boîtes de Pétri.

7.4.1 Produits liquides et semi-liquides

Prélever la quantité appropriée à l'aide de pipettes stériles ou d'un autre dispositif stérile.

7.4.2 Produits solides et semi-solides

Les microorganismes viables peuvent se retrouver à certains endroits dans les produits solides et semi-solides. Ils se trouveront plus probablement au centre du produit si le traitement n'a pas été suffisant, ou près des sertis ou de la fermeture si le contenant a fui.

On peut prélever des échantillons au centre des contenants en utilisant un instrument approprié, comme par exemple un perce-bouchon stérilisé. Pour soumettre la surface externe de produits solides à un échantillonnage adéquat, il faut prélever tout le contenu, si possible, de la boîte et le transférer dans un plateau stérile. Pour se faire, il faudra probablement enlever complètement le fond de la boîte au moyen d'un ouvre-boîte ordinaire stérilisé. Si l'analyste prévoit soumettre cette unité d'échantillon à une épreuve de détection des fuites sous vide, il faut alors procéder à cette analyse avant d'enlever le fond de la boîte.

Si l'on doute de l'intégrité des deux sertis et si l'on prévoit procéder à d'autres tests pour l'évaluer, il faudra utiliser d'autres moyens aseptiques pour ouvrir la boîte afin de pouvoir en extraire tout le contenu d'un seul coup. Dans certains cas, il est possible d'ouvrir les boîtes pourvues d'une entaille en utilisant la clé fournie à cet effet ou un instrument semblable. Si l'on utilise la clé, vérifier la présence de toute altération autour de l'entaille avant d'ouvrir la boîte.

Utiliser une spatule stérile pour prélever l'échantillon en grattant la surface externe du produit, tout particulièrement à proximité des sertis. Dans la plupart des cas, on prélèvera des échantillons du centre du contenu ainsi que de sa surface externe.

7.5 Analyse microbiologique du contenu

Pour les diagrammes expliquant la marche à suivre lors des analyses microbiologiques, voir les schémas.

Pour déterminer la stérilité commerciale :

Si la température normale d'entreposage ou de manipulation du produit dépasse 40 C, le produit devra être analysé pour les thermophiles. Sinon, procéder à « l'isolement des mésophiles » seulement.

Pour les autres échantillons :

Les échantillons, comme ceux provenant de lots dont le traitement thermique est insuffisant, incriminés dans des toxi-infections alimentaires ou qui proviennent de boîtes visiblement bombées, doivent être analysés pour les mésophiles et les thermophiles.

Témoins Voir le point 8.2 sur l'utilisation des témoins de produits alimentaires négatifs et de témoins des milieux négatifs et positifs. Il faut utiliser des témoins pendant toute l'analyse qui suit.

7.5.1 ISOLEMENT DES MÉSOPHILES :

Note: On peut utiliser une température spécifique entre 30 °C et 35 °C, mais la température choisie ne doit pas varier de plus de ± 1,0 °C.

7.5.1.1 ALIMENTS PEU ACIDES (voir schéma)

Enrichissement :

Ensemencer 2 tubes de PE-2 stériles et 2 tubes de CMM stériles. Inclure dans l'essai des milieux témoins positifs et des milieux témoins négatifs. Voir les points 8.2.1 et 8.2.2. Incuber en aérobiose à 30-35 oC pendant au moins 14 jours. Examiner le tubes tous les jours pour y déceler la présence d'une croissance. Faire des ensemencements sur des géloses de PCA, TSA ou BA en double provenant de tous les tubes positifs et les tubes que l'on soupçonne d'être positifs. Incuber une gélose en aérobiose et une gélose en anaérobiose à 35 oC pendant de 2 à 5 jours. et examiner chaque jour. Pour les anaérobies, on peut utiliser des géloses RCM ou LVA incubées en anaérobiose. Déterminer la réaction à la coloration de Gram, ainsi que la morphologie des cellules pour chaque type de colonies observées sur les plaques.

Ensemencement direct (voir schéma)

On utilise généralement les géloses PCA, TSA ou BA.; cependant pour les anaérobies, on peut utiliser les milieux RCM ou LVA. Dans les cas où l'on soupçonne la présence de micro-organismes particuliers, il convient d'utiliser des milieux correspondants comme, par exemple, les milieux de Baird-Parker, de MacConkey, etc.

Ensemencer ou couler deux géloses PCA (on peut utiliser des géloses RCM ou LVA pour les anaérobies) et incuber une plaque en aérobiose et une plaque en anaérobiose à 35 oC pendant 2 à 5 jours. Observer les types de colonies sur chaque plaque. Déterminer la réaction à la coloration de Gram, ainsi que la morphologie cellulaire de chaque type de colonie.

7.5.1.2 ALIMENTS ACIDES ET PEU ACIDES ACIDIFIÉS (voir schéma)

Enrichissement :

Ensemencer deux tubes de milieu AB stérile. Lorsque le produit est fluide ou semi-fluide, on peut utiliser comme milieu de croissance, de remplacement ou supplémentaire, le produit alimentaire normal lui-même, après re-stérilisation. (Si le produit alimentaire est solide, il peut être nécessaire d'y ajouter de l'eau distillée portée récemment à ébullition pour obtenir la bonne consistance.)

Incuber une série de tubes en aérobiose et l'autre en anaérobiose à 30-35 °C pendant au moins 14 jours. Examiner la croissance dans les tubes après 3, 7 et 14 jours. (Comme il est souvent difficile d'observer la croissance bactérienne lorsqu'on utilise des produits alimentaires comme milieux de culture, on devrait plutôt faire des frottis directs et ensemencer des géloses pour déterminer la croissance). Faire des ensemencements en stries sur des géloses PDA en double et sur des géloses coulées de TA en double.

Incuber les plaques en aérobiose et en anaérobiose à 30 °C pendant 2 à 5 jours et les examiner tous les jours. Déterminer la réaction à la coloration de Gram, ainsi que la morphologie cellulaire pour chaque type de colonie observée sur les plaques.

Ensemencement direct (voir schéma)

Ensemencer ou couler deux géloses PDA et deux géloses TA et incuber une gélose en aérobiose et l'autre en anaérobiose à 35 °C pendant 2 à 5 jours. Observer les types de colonies sur chaque plaque. Déterminer la réaction à la coloration de Gram, ainsi que la morphologie cellulaire de chaque type de colonie. Ensemencer d'autres milieux appropriés lorsque l'on soupçonne la présence de certains micro-organismes en particulier.

7.5.2 ISOLEMENT DES THERMOPHILES :

7.5.2.1 ALIMENTS PEU ACIDES (voir schéma)

Enrichissement :

Ensemencer 2 tubes de PE-2 stériles et 2 tubes de CMM stériles. Soumettre un tube de chaque type de milieu ensemencé à un choc thermique pendant 10 minutes à 80 °C (s'assurer que les milieux ont atteint la température de 80 °C avant de commencer à compter les 10 minutes). Incuber tous les tubes à 55 °C pendant au plus 7 jours et les examiner tous les jours. Manipuler les tubes positifs et les tubes suspects de la façon décrite au point 7.5.1.1 sauf incuber les plaques à 55 °C.

Ensemencement direct

Note : pour le lait et produits laitiers de longue conservation : afin d'aider à la récupération des micro-organismes, ajouter 1 ml de produit restérilisé à chaque litre de milieu tempéré avant de verser dans les plaques.

Ensemencer ou couler deux géloses PCA (on peut utiliser deux géloses RCM ou LVA pour les micro-organismes anaérobie) et incuber une gélose en aérobiose et l'autre en anaérobiose à 55°C pendant 2 à 5 jours. Observer les types de colonies sur chaque plaque. Déterminer la réaction à la coloration de Gram, ainsi que la morphologie cellulaire de chaque type de colonie.

7.5.2.2 ALIMENTS ACIDES ET ALIMENTS PEU ACIDES ACIDIFIÉS (voir schéma)

Enrichissement :

Ensemencer 2 tubes de milieu acide stérile ou 2 tubes de milieu fait à partir du produit alimentaire restérilisé (la façon décrite ci-dessus). Suivre la méthode décrite ci-dessus pour les thermophiles.

Ensemencement direct

Ensemencer ou couler deux géloses PDA et deux géloses TA, et incuber une gélose en aérobiose et l'autre en anaérobiose à 55°C pendant 2 à 5 jours. Observer les types de colonies sur chaque plaque pour en déterminer la réaction à la coloration de Gram, ainsi que la morphologie cellulaire de chaque type de colonie. Ensemencer d'autres milieux appropriés lorsqu'on soupçonne la présence de certains micro-organismes en particulier.

7.6 Unités d'échantillonnage retenues

Les unités d'échantillonnage retenues peuvent être utilisées pour la recherche des toxines

(C. botulinum: voir MFHPB-16; S. aureus: voir MFLP-47; etc.), pour des analyses chimiques (par exemple, pour la détermination du pH) ou encore pour répéter des analyses microbiologiques dans le but de vérifier les résultats. Cependant, les températures de réfrigération peuvent modifier la densité bactérienne et il faut interpréter avec prudence les résultats obtenus à partir de ces unités d'échantillonnage.

7.7 Examen microscopique direct (EMD) du produit

(voir la méthode MFHPB-02)

On peut souvent démontrer, par examen microscopique direct du produit, la présence d'une croissance bactérienne antérieure ou postérieure au traitement thermique de l'aliment. Même s'il n'est pas nécessaire de procéder à cet examen dans des conditions aseptiques, les frottis devraient être préparés après l'échantillonnage du contenu.

7.8 Détermination du pH

(voir MFHPB-03)

La croissance microbiologique entraîne souvent une modification importante du pH. Le pH de l'échantillon d'aliment peut donc être un indice d'une croissance bactérienne et il faut le

déterminer aussitôt que possible après le prélèvement de l'échantillon.

7.9 Examen organoleptique

Examiner le produit pour y déceler toute odeur bizarre ou d'autres signes de détérioration : mousse, grumeaux, décoloration, etc. NE PAS GOÛTER AU PRODUIT. Noter les observations.

7.10 Identification des micro-organismes

Même s'il n'est pas nécessaire de procéder à une identification détaillée des micro-organismes viables afin de déterminer s'il y a conformité avec la Loi sur les aliments et drogues et ses règlements d'application, il peut être souhaitable dans certains cas (actions de conformité, rappels, etc.) d'identifier les isolats obtenus à la suite de l'ensemencement des tubes positifs. Ce besoin sera sujet aux circonstances particulières à chaque cas. Dans les cas de rappel du produit et dans les actions de conformité, il peut être nécessaire d'identifier tous les micro-organismes. Dans certains cas, il peut être nécessaire d'envoyer les cultures à un laboratoire de référence.

7.11 Disposition des déchets

Avant la disposition, stériliser le contenant et son contenu à l'autoclave après l'échantillonnage s'il y a lieu de croire que le contenu n'est pas commercialement stérile. Si l'on soupçonne la présence de C. botulinum, il faut alors stériliser le contenant et son contenu à l'autoclave avant disposition.

8. PROCÉDURES DE CONTRÔLE DE LA QUALITÉ

Bien que les procédures normales de contrôle de la qualité au laboratoire de microbiologie s'appliquent, il convient de porter une attention particulière aux points suivants en raison de la nature de la présente méthode :

8.1 Hottes à écoulement d'air laminaire et salle propres

8.1.1 Hotte à écoulement laminaire

Effectuer un test de provocation au dioctylphtalate (DOP), ou un test équivalent, et mesurer la vitesse de l'air au moins une fois par année, et plus fréquemment au besoin. Consigner les résultats des tests.

8.1.2 Enceinte de biosécurité

Si l'on utilise une enceinte de biosécurité, l'enceinte doit être certifiée au moins une fois par année et consigner les résultats des tests de certification.

8.1.3 Salles propres (classe 10 000 ou 100 000)

Vérifier périodiquement la qualité microbiologique de l'air dans les salles à l'aide d'un échantillonneur d'air à fente de type Lusella, ou par l'exposition de boîtes de Petri ouvertes pendant une heure, ou par les deux méthodes. Consigner les résultats de touts les tests.

Pour les salles propres de classe 10 000, ces tests doivent être effectués une fois durant chaque opération, ou une fois par semaine si la salle est continuellement en opération.

Pour les salles propres de classe 100 000, ces tests doivent être effectués de façon continuelle durant toutes les opérations.

8.2 Témoins

8.2.1 Témoin alimentaire négatif

Si jugé approprié, un témoin alimentaire négatif peut être préparé. On peut préparer le témoin alimentaire négatif à partir d'une unité d'échantillonnage ou d'un aliquot provenant du produit que l'on a fait stériliser à l'autoclave à 121 C pendant 15 minutes. Inoculer deux tubes de PE-2 et deux tubes de CMM en y ajoutant un aliquot de l'aliment stérile.

Note : Un témoin alimentaire négatif peut être utile dans l'interprétation des résultats lorsqu'on soupçonne que les données ne produiront pas de réponses claires quant à la stérilité commerciale d'un produit ou lorsque les résultats obtenus auparavant avec le même produit étaient contradictoires.

8.2.2 Témoins des milieux

Témoin négatif

Pré-incuber les milieux pendant au moins deux jours ou incuber une unité de milieu par échantillon pour chaque lot de milieu utilisé. Consigner tous les résultats.

Témoin positif

Ensemencer une unité par lot avec les micro-organismes appropriés (Annexe A.10-13) à la composition du milieu et à la température d'incubation indiquées ci-dessous. Consigner tous les résultats.

Microorganisme	Milieux	Température d'incubation
1. Clostridium sporogenes ou C. Histolyticum	PE2, CMM, LVA	35°C
2. Bacillus coagulans	Gélose thermoacidurans,Bouillon acide, PDA	30°C
3. B. stearothermophilus	PE2, CMM, PCA	55°C
4 C. thermosaccharolyticum	PE2, CMM, LVA	55°C

9. RÉFÉRENCES

L'analyste peut se référer aux documents suivants, ou à d'autres références appropriées :

9.1 American Public Health Association (APHA). 1992. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 3^rd edition, American Public Health Association, Washington, D.C.

9.2 Anon. 1994. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. 9th edition. W.R. Hensyl (editor). The Williams and Wilkins Co., Baltimore.

9.3 Anon. 1973. Norme fédérale (É.-U.) 209B : Clean Room and Work Station Requirements, Controlled Environment 1973.

9.4 Association of Official Analytical Chemists, (AOAC). 1995. Bacteriolobical Analytical Manual, Arlington, Virginie, chapitre 21.

9.5 Atlas, R.M. 1997. Handbook of Microbiological Media, 2^nd edition, L.C. Parks (editor). CRC Press Inc.

9.6 Austin, P.R. 1970 Design and Operation of Clean Rooms. Revised Edition. Business News Publishing Company, Birmingham, Michigan.

9.7 Santé Canada. 1996. Lignes directrices en matière de biosécurité en laboratoire. Laboratoire de lutte contre la maladie, Santé Canada.

10. PRÉPARATION DES MILIEUX

Pour procéder à une stérilisation à la vapeur, il est essentiel que la charge soit chauffée suffisamment au préalable avant le début de la période de stérilisation proprement dite. La période varie considérablement en fonction de la nature et du volume de la charge. C'est pourquoi il faut se conformer au temps de stérilisation qui convient si l'on veut assurer la stérilisation des solutions en flacon et des milieux de culture thermostables, surtout lorsqu'il s'agit de quantités importantes (consulter le manuel du stérilisateur).

10.1 Bouillon acide (AB)

Protéose-peptone	5 g
Extrait de levure	5 g
Dextrose	5 g
K2PO4	4 g
Eau distillée	1 000 ml

Ajuster le pH du milieu au pH de l'aliment analysé en y ajoutant du HCI 1N. Stériliser à 121°C pendant 20 minutes ou l'équivalent.

10.2 Milieu de viande cuite (CMM)

Coeur de boeuf	454 g
Protéose-peptone	20 g
Dextrose	2 g
Chlorure de sodium	5 g

On peut préparer ce milieu en répartissant 2,5 g d'un milieu préparé et déshydraté dans des éprouvettes de 20 x 150 mm munies de bouchons qui vissent, en y ajoutant 20 ml d'eau distillée froide, puis en laissant reposer, après avoir bien mélangé, de façon à permettre l'humidification complète de toutes les particules. Faire stériliser pendant 15 minutes à 121°C ou l'équivalent. Le pH final du milieu doit être de 7,2. On peut habituellement conserver le milieu préparé, une fois stérilisé, à une température de 0°C à 4°C, sans détérioration, jusqu'à 4 semaines. Avant de l'utiliser, il faut autoclaver le milieu réfrigéré à 100 °C ou le faire bouillir pendant 10 minutes, pour le désaérer.

10.3 Solution désinfectante chlorée pour les contenants

Solution tampon mère (solution 1,0 molaire)

Phosphate dipotassique (KH2PO4)	136 g
Eau distillée	1 000 ml

Ajuster le pH à 6,2 avec une solution de NaOH 1 N.

Préparation d'une solution désinfectante chlorée tamponnée Diluer 20 fois la solution tampon mère (par exemple, diluer 5 ml de la solution tampon à 100 ml avec de l'eau distillée). Si l'on prévoit conserver la solution mère diluée pendant plus d'une journée, il faut la stériliser à 121°C, pendant 15 minutes dans des bouteilles appropriées avant de l'utiliser.

Préparer la solution chlorée en ajoutant 10 ml d'une solution chlorée commerciale (comme du Javex dont la teneur en chlore disponible est de 5,25 % ou toute autre solution chlorée de concentration comparable) à un litre de la solution tampon diluée (1/20M). La concentration finale de chlore disponible devrait se situer entre 500 et 525 ppm et le pH final de la solution devrait être de 6,5. La concentration de chlore disponible dans la solution ne doit pas être inférieure à 100 ppm.

10.4 Gélose au foie de veau (LVA)

Infusion de foie	50 g
Infusion de veau	500 g
Protéose-peptone	20 g
Néopeptone	1,3 g
Tryptone	1,3 g
Dextrose	5,0 g
Amidon soluble	10,0 g
Caséine isoélectrique	2,0 g
Chlorure de sodium	5,0 g
Nitrate de sodium	2,0 g
Gélose	15,0 g
Eau distillée	1000 ml

Mélanger les ingrédients dans l'eau distillée. Faire stériliser à 121°C pendant 15 minutes.

Le pH final doit être de 7,3 ± 0,3.

10.5 Milieu PE-2 modifié (PE-2)

Milieux de base :

Peptone	20 g
Extrait de levure	3 g
Solution alcoolique de bromocrésol pourpre à 2%	2 ml
Eau distillée	1000 ml
Pois de semence de l'Alaska	8-10/tube

Faire dissoudre les ingrédients en chauffant doucement, au besoin, et transvider des portions de 19 ml dans des éprouvettes de 20 x 150 mm munies de bouchons qui vissent et contenant chacune de 8 à 10 pois de semence de l'Alaska non traités. (On peut commander ces pois chez W.H. Perron, 515, boul. Labelle, Laval (Québec)). Stériliser pendant 30 minutes à 121°C ou l'équivalent. On peut habituellement conserver jusqu'à 4 semaines le milieu préparé, une fois stérilisé, à une température de 0°C à 4°C, sans qu'il se détériore. Avant de l'utiliser, il faut passer le milieu réfrigéré à l'autoclave à 121°C ou le faire bouillir pendant 10 minutes, pour le désaérer. Faire refroidir à la température de la pièce avant l'emploi.

10.6 Gélose au sérum à l'orange (OSA)

Tryptone ou trypticase	10,0 g
Extrait de levure	3,0 g
Dextrose	4,0 g
Phosphate dipotassique	2,5 g
Gélose	17,0 g
Cystéine	0,001 g
Sérum à l'orange	200 ml
Eau distillée	800 ml

Dissoudre les ingrédients dans l'eau distillée. Préparer le sérum à l'orange en faisant chauffer un litre de jus fait d'oranges fraîchement pressées ou de concentré de jus d'orange congelé reconstitué, jusqu'à une température d'environ 93°C (200°F). Ajouter 30 g d'« adjuvant de filtration » et bien mélanger. Filtrer par succion dans un entonnoir Buchner sur un papier filtre de forte porosité préalablement enrobé d'« adjuvant de filtration ». Jeter les premiers millilitres de sérum filtré.

Stériliser pendant 15 minutes à 121°C. Après la stérilisation, le pH doit être d'environ 5,5. Ne pas recouvrir l'autoclave.

10.7 Gélose pour numération sur plaque (PCA)

Tryptone	5 g
Glucose	1 g
Extrait de levure	2,5 g
Gélose	15 g

Ajouter tous les ingrédients à 1 litre d'eau distillée, porter à ébullition en agitant constamment de façon à dissoudre complètement tous les ingrédients. Faire refroidir jusqu'à une température de 45 à 60°C et ajuster le pH de la solution de façon à le fixer à 7,0 ± 0,1 après la stérilisation à l'autoclave. Répartir au besoin et stériliser à l'autoclave à 121°C pendant 15 minutes, ou l'équivalent. Pour les produits laitiers de longue conservation, l'addition de 1 ml de produit restérilisé au milieu refroidi avant de verser sur les boîtes de Petri peut faciliter la récupération des micro-organismes.

10.8 Gélose pommes de terre et dextrose - acidifiée

Milieux de base :

Infusion de pommes de terre blanches	200 ml
Dextrose	20,0 g
Gélose	15,0 g
Eau distillée	1000 ml
Acide tartarique à 10 %	16,0 ml

Préparer une suspension de 39 grammes d'ingrédients déshydratés disponibles dans le commerce, dans de l'eau distillée. Porter à ébullition pour dissoudre les ingrédients. Stériliser à l'autoclave à 121 °C (15 l. de pression) pendant 15 minutes et laisser refroidir à 45-50 °C. Abaisser le pH à 3,5 ± 0,1 en ajoutant 16 ml d'acide tartarique stérile à 10 % et distribuer dans des boîtes de Pétri. Ne pas faire chauffer de nouveau le milieu acidifié, car cela hydrolysera la gélose.

10.9 Milieu clostridial renforcé (RCM)

Extrait de levure	3 g
Extrait de boeuf	10 g
Peptone	10 g
Amidon soluble	1 g
Dextrose	5 g
Chlorhydrate de cystéine	0,5 g
Acétate de sodium anhydre	3 g
Chlorure de sodium	5 g
Gélose (pour milieu solide)	15 g
Eau distillée	1 000 ml

Porter à ébullition pour dissoudre les ingrédients et ajuster le pH à 7,4. Stériliser à l'autoclave à 121°C pendant 15 minutes, ou l'équivalent.

10.10 Gélose de Sabouraud au dextrose (SDA)

Dextrose	40,0 g
Peptone	10,0 g
Gelose	15,0 g
Eau distillée	1 000 ml

Dissoudre les ingrédients dans l'eau distillée et porter à ébullition; répartir dans les récipients appropriés et les faire stériliser à l'autoclave à 121°C pendant 15 minutes. Le pH doit être de 5,6 ± 0,2. Ne pas stériliser plus longtemps que nécessaire.

10.11 Gélose thermoacidurans (TA)

Extrait de levure	5,0 g
Protéose-peptone	5,0 g
Dextrose	5,0 g
Phosphate dipotassique	4,0 g
Gélose	20,0 g
Eau distillée	1 000 ml

Suspendre les ingrédients dans l'eau distillée et faire dissoudre la gélose en faisant bouillir. Répartir le milieu dans les récipients appropriés. Stériliser à l'autoclave pendant 15 minutes à 121°C. Le pH final doit être de 5,0.

Schéma 1. Analyse microbiologique d'aliments en conserve peu acides au moyen de milieux liquides aérobie/anaérobie

Schéma 2. Analyse microbiologique d'aliments en conserve acides ou acidifiés au moyen de milieux aérobie ou anaérobie

Schéma 3. Analyse microbiologique d'aliments en conserve par ensemencement direct