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Détection de Clostridium botulinum et de ses toxines dans des aliments suspects et des prélèvements cliniques
Méthode de la DGPS MFHPB-16
Mars 2009
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(Version PDF - 46 ko) Direction générale des produits de santé et des aliments
Ottawa
Détection de Clostridium botulinum et de ses toxines dans des aliments suspects et des prélèvements cliniques
John W. Austin et Greg Sanders
Division de la recherche microbiologique
Bureau de dangers microbiens
Direction des aliments
Localisateur postal : 2204E
Ottawa (Ontario) K1A 0K9
Courriel: john_austin@hc-sc.gc.ca
1. Application
Cette méthode s’applique à la détection de la toxine botulinique et de C. botulinum viable dans des aliments suspects et des prélèvements cliniques, conformément à l’article 4 de la Loi sur les aliments et drogues. Tout le travail analytique doit être effectuée en collaboration avec le Service de référence pour le botulisme situé à Ottawa. La présente version révisée remplace la méthode MFHPB-16 datée d’avril 1997.
2. Description
2.1 La méthode décrite ci-dessous laisse certains détails de la procédure à la discrétion du laboratoire, selon les échantillons d’aliments et les prélèvements cliniques disponibles et le type le plus probable de C. botulinum en cause dans une éclosion donnée. Il y a deux groupes distincts de souches de C. botulinum en cause dans les éclosions chez les êtres humains, soit les groupes I et II, ceux des formes protéolytique et non protéolytique, respectivement. Des renseignements de base sur le lieu des éclosions, les aliments soupçonnés et l’ethnie des victimes peuvent laisser supposer la présence d’un groupe en particulier et aider ainsi à simplifier la méthode. Le Tableau 1 présente quelques caractéristiques pertinentes à la méthode d’analyse.
2.2 Botulisme lié aux souches protéolytiques de C. botulinum
2.3 Botulisme lié aux souches non protéolytiques de C. botulinum
2.4 mesures de sécurité
3. Principe
3.1 Le diagnostic du botulisme d'origine alimentaire est généralement confirmé si, outre le syndrome clinique, on décèle dans l'aliment suspect ou dans le prélèvement clinique la toxine botulinique ou des spores viables de C. botulinum . Les prélèvements qui se prêtent bien à la recherche de la toxine sont le sérum, les fèces, le liquide de lavement et le contenu gastrique. Les mêmes prélèvements, à l'exception du sérum, peuvent également servir à dépister C. botulinum .
3.2 Les études en laboratoire sur le botulisme chez les nourrissons sont généralement limitées à la recherche de la toxine et de C. botulinum dans les selles. Les cas où l'on a signalé la présence de concentrations décelables de toxine dans le sérum sont rares. Les échantillons environnementaux et alimentaires peuvent être analysés pour détecter la présence des spores de C. botulinum .
3.3 Pour déceler la toxine botulinique, on injecte à des souris du sérum ou des extraits tirés d'aliments et de prélèvements cliniques, puis on observe la létalité et la neutralisation de la toxine par des antisérums spécifiques. Pour détecter C. botulinum , il faut faire incuber en milieu anaérobie des aliments et des prélèvements cliniques dans des milieux liquides, puis rechercher la toxine. En cas d'éclosions importantes, ou lorsqu'on découvre des sérotypes rares, on isole les micro-organismes en cause après les analyses.
4. Définitions
Voir l'Appendice A du Volume 2
5. Prélèvements
5.1 Prélèvements d'aliments
On peut utiliser des restes ou des contenants non ouverts. Dans le cas des aliments commerciaux, il importe de conserver l'étiquette, le numéro de lot du fabricant, les codes en relief sur la boîte ou l'emballage, etc.
5.2 Prélèvements cliniques
Les prélèvements cliniques qui conviennent aux analyses comprennent les fèces (environ 10 g) ou les eaux de lavement, le contenu gastrique (après en avoir ajusté si possible le pH à environ 6,0 en utilisant du NaOH 1N) et le sérum (tiré de 20 mL de sang prélevé AVANT l'administration de l'antitoxine). Lorsqu'on soupçonne la présence du botulisme chez le nourrisson, il faut absolument en analyser les fèces. On peut au besoin utiliser les parties souillées des couches.
5.3 Expédition d'échantillons d'aliments et de prélèvements cliniques pour le diagnostic
6. Matériel et produits spéciaux
1) NaOH 0,1N ou NaHCO3 saturé pour nettoyer les déversements possibles
2) hotte à flux laminaire
3) appareil de pipetage
4) lunettes de sécurité
5) gants chirurgicaux
6) centrifuge réfrigérée d'une capacité de 15 000 x g
7) seringues jetables avec aiguilles d'un pouce de calibre 19
8) filtres jetables de 0,45 μm avec seringues à vis Luer (e.g. Luer locks) (Whatman 25 mm GD/X PVDF)
9) agitateur-mélangeur vortex
10) " Stomacher " ou mélangeur
11) pH mètre
12) éprouvettes (env. 13 x 100 mm)
13) antisérums monovalents des types A, B, E et F
14) seringues et aiguilles à tuberculine munies d'aiguilles 25G½
15) souris
16) solution tampon au phosphate de gélatine
17) trypsine à 1 % p/v
18) milieu de viande cuite (MVC; disponible dans le commerce)
19) bouillon de trypticase-peptone-glucose-extrait de levure (TPGY)
20) gélose d'isolement de clostridium botulinum (CBI)
21) gélose McClung Toabe (disponible dans le commerce, Difco)
22) bain d'eau à 75° C
23) éthanol à 50 % ou absolu
24) chambre anaérobie (p. ex. chambre Coy, Ann Arbor, MI) contenant un incubateur à 35°C
7. Marche à suivre
7.1 Examen des aliments suspects au microscope
Cet examen n'est pas essentiel pour déceler la présence de C. botulinum , mais il peut faciliter la sélection d'aliments suspects à analyser. Préparer des frottis par examen direct et une coloration de Gram. Si les aliments contiennent trop de matières grasses, plonger les lames fixées à la chaleur pendant une à deux minutes dans du xylol avant de les colorer.
7.2 Préparation des produits pour la recherche de toxines
Centrifuger environ 20 mL à 15 000 x g pendant 20 min. Décanter avec précaution le liquide surnageant en veillant à maintenir dans le tube toute matière grasse superficielle, ou soutirer le liquide surnageant au moyen d'une seringue jetable munie d'une longue aiguille (1 po, calibre 19). Boucher le tube et conserver à 4 C afin de pouvoir procéder ultérieurement à la mise en culture du sédiment. Centrifuger de nouveau si le liquide surnageant n'est pas limpide. Stériliser le liquide surnageant en filtrant au moyen d'une membrane de 0,45 μm munie d'une seringue jetable. Il est parfois préférable d'utiliser un pré filtre pendant la filtration. La stérilisation vise à éviter l'infection et la mort non spécifique des souris qui ont reçu une injection.
Déposer de 10 à 15 g d'aliment dans un tube à centrifuger de 40 mL, verser un volume égal de solution tamponnée de phosphate de gélatine, et homogénéiser dans un agitateur-mélangeur vortex . Centrifuger et procéder de la façon décrite en 7.2.1.
Déposer de 10 à 20 g dans un sac à " stomacher ", dans un mélangeur ou dans un mortier. Ajouter suffisamment de solution tamponnée de phosphate de gélatine pour obtenir au moins 10 mL de liquide surnageant limpide après centrifugation. Le ratio aliment:diluant doit être généralement de l'ordre de 1:1 à 1:3. Laisser macérer. Faire fonctionner le " stomacher " ou le mélangeur (à grande vitesse) pendant une à deux minutes. Il faut fermer hermétiquement les récipients à mélanger pour éviter la diffusion d'aérosols. Placer les échantillons dans des sacs doubles avant de les insérer dans le " stomacher ". Centrifuger et procéder de la façon décrite en 7.2.1.
Nettoyer et faire sécher la surface. Recouvrir le couvercle d'une couche d'éthanol à 96 %, laisser reposer pendant deux minutes, décanter et éliminer le résidu d'alcool à la flamme. Placer la boîte dans un grand sac en plastique pour éviter la diffusion d'aérosols et ouvrir avec un ouvre-boîte stérile. Procéder de la façon décrite ci dessus (7.2.1, 7.2.2 ou 7.2.3).
L'idéal serait d'obtenir 10 mL de sérum. Le sérum n'est utile que s'il est prélevé avant le traitement à l'antisérum. S'il est trouble, il faut le centrifuger à 15 000 x g pendant 20 minutes et décanter le liquide surnageant. On peut aussi filtrer le sérum à l'aide d'un filtre à usage unique de 0.45μm,
Déposer environ 10 g dans un tube à centrifuger de 40 mL, ajouter suffisamment de diluant pour obtenir au moins 10 mL de liquide surnageant après la centrifugation. S'il n'est pas possible d'obtenir 10g, ajouter suffisamment de diluant pour ramollir les selles et obtenir de 7 à 10 mL de surnageant. Mélanger dans un agitateur-mélangeur vortex pendant deux ou trois minutes jusqu'à ce que l'échantillon soit complètement homogénéisé. Centrifuger et procéder de la façon décrite en 7.2.1. Il est généralement possible de centrifuger directement, avec un peu ou sans diluant, les selles liquides, les eaux de lavement et les contenus gastriques. Filtrer les surnageants à l'aide d'un filtre Whatman de 0.45μm monté sur seringue. Il est parfois impossible de filtrer le liquide surnageant de certains échantillons de selles. Centrifuger les surnageants non filtrables dans un tube de type Eppendorf à 14,000 rpm pour 8 à 10 minutes, puis filtrer la portion supérieure de l'échantillon à l'aide d'un filtre Whatman de 0.45μm monté sur seringue. Si le filtrat du surnageant est très foncé et/ou trouble, des réactions non spécifiques peuvent être obtenues chez la souris qui pourraient masquer les symptômes associées à la neurotoxine botulinique. Si cette situation est susceptible de se produire, diluer le surnageant jusqu'à ce que la couleur devienne ambrée et/ou qu'elle semble moins trouble à l'observation. Dans les cas où des enfants sont impliqués, de très petites quantités de fèces, des couches souillées ou des écouvillons anaux seront obtenus. Ajuster le volume de diluant à la baisse à 7 mL. Pour les couches souillées et les écouvillons anaux, découper la région de l'échantillon contenant des matières fécales à l'aide de ciseaux stériles et les mettre dans le diluant. Mélanger par vortex de 2 à 3 minutes, retirer le matériel non fécal à l'aide de petites pinces stériles, procéder ensuite à l'étape de centrifugation initiale.
Mesurer le pH et l'amener avec soin, au besoin, à 5.5 - 6.5 avec du NaOH 1 N. Ne pas laisser le pH monter à plus de 7,0. Centrifuger et procéder de la façon décrite en 7.2.1.
7.3 Recherche des toxines
Cette épreuve détermine si la toxine est présente dans les échantillons cliniques ou alimentaires. Si la toxicité est retrouvée dans l'échantillon non traité ou traité à la trypsine, et que les symptômes sont typiques aux neurotoxines botuliniques (i.e. (poils ébouriffés, respiration abdominale pénible, membres faibles, resserrement de la taille, et paralysie générale précédant la mort), il est possible alors que l'échantillon contienne la neurotoxine botulinique. Même si la neurotoxine botulinique, cause généralement la mort chez la souris à l'intérieur d'une période de 2 à 24 heures, des décès retardés sont observés à l'occasion. Si la toxine est présente en quantité suffisante, toutes les souris injectées avec les échantillons à l'épreuve manifesteront des symptômes ou décéderont à l'exception de celles qui ont été injectées avec les extraits chauffés (maintenus dans l'eau bouillante pour 10 minutes) car la toxine botulinique est thermolabile. La présence de la toxine botulinique ne peut être confirmée que par sa neutralisation avec une antitoxine spécifique.
b) en cas de toxicité exceptionnellement élevée seulement, diluer l'échantillon avec de la solution tamponnée de phosphate de gélatine à 1:10 et répéter l'essai de neutralisation; ou
c) inclure l'antisérum F à l'essai de neutralisation.
d) Si la présence d'une souche produisant deux types de toxines est suspectée, répéter l'épreuve de neutralisation en utilisant une combinaison de toxines A+B, B+F ou A+F
S'il faut déterminer la concentration de toxines, effectuer des dilutions décimales des liquides surnageants traités à la trypsine et des liquides surnageants non traités, généralement jusqu'à 1:1 000, selon la concentration prévue de toxine, sans toutefois dépasser 1:10 000 initialement. Injecter chaque dilution à deux souris. L'inverse de la plus grande dilution causant la mort x 2 correspond à la DLS minimale/mL : par exemple, si la mort survient à la dilution 1:100, mais non à la dilution 1:1 000, la concentration de toxine est alors de l'ordre de 200 à 2 000 DLS/mL.
7.4 Détection de C. botulinum viable
7.5 Isolement de C. botulinum à partir de cultures toxiques
Note : Des cultures plus anciennes de C. botulinum peuvent devenir Gram négatives.
Note : De nombreux repiquages des colonies sont nécessaires, puisque d'autres colonies de Clostridium spp. de même apparence peuvent masquer la présence de C. botulinum .
7.5.3.2 Si les Clostridium spp. n'ont pas produit de sporulation dans le bouillon d'enrichissement toxique, incuber de nouveau pendant une semaine à 30̊C, ou déposer 0,1 mL de culture sur de la gélose TPGY et faire incuber les boîtes en milieu anaérobie à 30̊C jusqu'à ce que des spores fassent leur apparition en nombres significatifs (habituellement 5 à 10 jours). Suspendre une pleine anse dans environ 2 mL d'éthanol à 50 %, conserver à la température ambiante pendant 60 minutes, ensemencer en stries une gélose aux jaunes d'oeufs McClung Toabe et sur de la gélose CBI, et procéder de la façon décrite en 7.5.1.
| Group | Typesa | Activation de la toxine par la trypsine | Résistance des spores à la chaleur (75°C pendant 20 minutes) | Croissance à moins de 10°C | Température qui favorise la croissance et la production de toxines |
|---|---|---|---|---|---|
| I | A, B, Fb |
± | + |
- | 30-37°C |
| II | Bc, E, Fb | + |
- | + |
26-30°C |
a Certaines souches rares des types A et B, représentant les sous-types AB, AF, BA, et BF, peuvent produire chacune une toxine importante (première lettre du sous-type) et une toxine mineure (deuxième lettre du sous-type)
b Non courant.
c Non courant en Amérique du Nord
| Tube n o. | Milieu | Traitement |
|---|---|---|
| 1 | CMM | Aucun |
| 2 | CMM | Traité à la Chaleur |
| 3 | TPGYT | Aucun |
| 4 | TPGYT | Alcool |
