Méthodes pour l'isolement et l'identification des salmonelles dans les aliments et les échantillons environnementaux

Méthode de la DPGS MFHP B-20
mars 2009

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1. APPLICATION

Cette méthode peut servir à détecter la présence de Salmonella viables dans les aliments et les échantillons environnementaux, afin de déterminer s'il y a conformité aux articles 4 et 7 de la Loi sur les aliments et drogues et les règlements spécifiques (tels que résumés dans le sommaire explicatif (7.15)) La présente version révisée remplace la méthode MFHPB-20 d'avril 1998. Pour des raisons de santé et de sécurité associées à l'utilisation du sélénite additionné de cystine, la présente méthode révisée devrait être utilisée en remplacement des Méthodes Officielles (du volume 1 de ce Compendium) MFO-6, MFO-10, MFO-11 et MFO-12.

La présente version révisée comprend les modifications importantes suivantes apportées à la méthode analytique de détection des Salmonella spp. d'origine alimentaire :

2. PRINCIPE

La méthode comporte six étapes distinctes.

2.1 Enrichissement en milieu non sélectif (pré-enrichissement).

La manipulation initiale de l'aliment et de l'enrichissement en milieu non-sélectif (pré-enrichissement) varie en fonction du type d'aliment analysé (7.6). Ensemencer l'échantillon d'analyse dans un milieu liquide non inhibiteur afin de favoriser la récupération et la croissance de salmonelles soumises à un stress ou endommagées par des facteurs sublétaux comme l'exposition à la chaleur, la congélation, la déshydratation, les agents de conservation, une forte pression osmotique ou d'importantes fluctuations de température (7.1; 7.6).

2.2 Enrichissement en milieu sélectif

Ensemencer des portions subdivisées de chaque culture de pré-enrichissement dans deux milieux d'enrichissement afin de favoriser le développement des salmonelles à travers une inhibition sélective de la croissance de microorganismes compétiteurs (7.4). Le bouillon d'enrichissement RVS (7.25 - 7.29) peut remplacer le bouillon SC pour la plupart des denrées alimentaires (voir la "Note" à la section 5, au point 8 pour les exceptions) .

2.3 Culture sur gélose sélective

Ensemencer en stries les bouillons d'enrichissement sur des géloses sélectives et différentielles pour isoler les salmonelles (7.5, 7.30).

2.4 Purification

Les isolats présumés de Salmonella sont purifiés sur gélose de MacConkey. Ceci permet d'éviter la possibilité que des organismes viables mais inhibés, provenant des géloses sélectives, contaminent la culture dans les épreuves supplémentaires.

2.5 Sélection biochimique

Les isolats sont identifiés en fonction de réactions biochimiques déterminantes.

2.6 Identification sérologique

On utilise des antisérums polyvalents et/ou somatiques de groupe pour confirmer l'identification des isolats comme Salmonella. Les cultures devraient être envoyées à un centre de référence en typage pour obtenir un typage sérologique complet.

3. DÉFINITIONS DES TERMES

Voir l'annexe A du Volume 2.

4. PRÉLÈVEMENT DES ÉCHANTILLONS

4.1 Échantillonnage

Voir l'annexe B du Volume 2.

Pour l'échantillonnage et les analyses courantes, 5 unités d'échantillonnage d'une quantité de 100g chacune doivent être prélevées de chaque lot à moins qu'il en soit précisé autrement au Tableau 1. Consulter le Sommaire explicatif (7.15) pour les lignes directrices et les réglements spécifiques aux aliments analysés pour Salmonella.

Pour des informations supplémentaires concernant les plans d'échantillonnage établis en fonction du niveau de risque et des conditions d'utilisation, se référer aux documents de l'ICSMF (7.16).

5. MATÉRIEL ET PRODUITS SPÉCIAUX

Les milieux et réactifs énumérés ci-après sont disponibles dans le commerce et doivent être préparés et stérilisés selon les instructions du fabricant. Voir aussi l'annexe G du volume 2 pour la composition des milieux.

1) Bouillon nutritif (BN)

2) Bouillon de trypticase soja (peptone trypsique, tryptone)

3) Solution aqueuse au vert brillant

4) Eau peptonée tamponnée (EPT)

5) Milieu au lait écrémé

6) Bouillon au tétrathionate additionné de vert brillant (TBG)

7) Bouillon au sélénite et à la cystine (SC) (Facultatif)

8) Bouillon Rappaport-Vassiliadis au peptone de soja (RVS)

9) Géloses sélectives et différentielles:

10) Gélose de MacConkey

11) Gélose nutritive

12) Gélose aux trois sucres et au fer (TSI)

13) Gélose lysine-fer (LIA)

14) Gélose à l'urée de Christensen

15) Trousses commerciales d'analyses biochimiques et trousses commerciales d'identification rapide (tels Vitek, API ou équivalent)

16) Antisérums somatiques polyvalents ou trousses d'agglutination au latex

17) Antisérums somatiques monovalents (0) et flagellaires (H) (Facultatif)

18) Solution saline physiologique

19) Mélangeur, Stomacher ou autre type d'homogénéisateur

20) Incubateurs capables de maintenir des températures de 35 °C et de 42.5 °C. Lorsqu'il est jugé approprié, les bains-marie peuvent être utilisés à la place des incubateurs.

21) Témoin : Lorsque disponible, utilisez des microorganismes en provenance d'une source reconnue tel que l'ATCC

1. Témoins positifs:

2. Témoins négatifs:

22) Trousse O.B.I.S (Oxoid: Facultatif)

6. PROCÉDURE

Chaque unité d'échantillonnage peut être analysée individuellement ou les unités d'analyses prélevées de chaque unité d'échantillonnage peuvent être combinées de façon appropriée.

Deux types de témoins (positifs et négatifs) doivent accompagner toutes les étapes de l'analyse.

6.1 Manipulation des unités d'échantillonnage

6.1.1 Avant l'analyse, à l'exception des aliments stables à la température de la pièce, conserver les unités d'échantillonnage au réfrigérateur (2-8°C) ou au congélateur, selon l'état dans lequel le produit a été reçu. Décongeler les échantillons congelés au réfrigérateur ou dans des conditions de temps et de température empêchant la croissance ou la destruction microbienne.

6.1.2 Analyser les unités d'échantillonnage le plus tôt possible après leur arrivée au laboratoire

6.1.3 Lors de plaintes de consommateurs ou lors d'enquêtes, le volume d'échantillon requis n'est pas toujours disponible. Si les unités d'échantillonnage reçus pour analyse sont d'une quantité inférieure au poids requis pour une unité d'échantillonnage, analyser l'unité d'échantillonnage tout entière et enregistrer le poids utilisé.

6.2 Enrichissement en milieu non sélectif (pré-enrichissement)

6.2.1 Groupement des unités d'analyse

Prélever une unité d'analyse ( généralement 25 g ou mL) à partir de chacune des unités d'échantillonnage. Afin de réduire la charge de travail, on peut réunir jusqu'à 15 unités d'analyse de 25 g (mL) en un seul échantillon d'analyse (p. ex., de 375 g ou mL).

Si une unité d'échantillonnage comporte plus d'un contenant, mélanger dans des conditions d'asepsie le contenu des contenants avant d'en prélever l'unité d'analyse. Si ce n'est pas possible ou pratique, l'unité d'analyse doit alors être constituée de portions égales de chaque contenant.

6.2.2 Analyse des échantillons

6.2.2.1 L'unité d'analyse requise (analysé individuellement ou en composite lorsqu'approprié) est mélangé dans un bouillon d'enrichissement non-sélectif approprié (Tableau 1). Le bouillon nutritif (NB) et l'eau peptonée tamponnée (EPT) sont aussi fiables l'un que l'autre et peuvent servir, de façon interchangeable, de milieu général de pré-enrichissement pour les types d'échantillons pour lesquels aucun autre buillon n'est spécifié (7.9). Mélanger à l'aide d'un appareil de type stomacher ou un autre mélangeur si approprié . (Voir Tableau 1)

6.2.2.2 Si le pH du mélange de pré-enrichissement n'est pas entre 6,0 et 7,0, il faut l'ajuster avec du NaOH 1N ou du HCI 1N.

6.2.2.3 Incuber le milieu de pré-enrichissement et les témoins à 35 °C pendant 18 à 24 h.

6.2.3 Réfrigération des cultures de pré-enrichissement (aliments secs) - FACULTATIF

6.2.3.1 Cette approche permet de réfrigérer les bouillons de pré-enrichissement incubés d'échantillons alimentaires secs à faible taux d'humidité (e.g. poudre d'oeufs entiers, chocolat au lait, nourriture animale et poudre de lait écrémé) pour une période de 72 heures, permettant ainsi une plus grande flexibilité analytique. (7.7, 7.8. 7.10, 7.11)

6.2.3.2 Les cultures de pré-enrichissement obtenues à partir des échantillons analysés la veille peuvent être réfrigérées (2 à 8 °C) jusqu'à 72 heures avant de pouvoir reprendre l'analyse (e.g. après la fin de semaine).

6.3 Enrichissement en milieu sélectif

6.3.1 Mélanger au vortex ou remettre en suspension les bouillons de pré-enrichissement. Transférer 1.0 mL de la culture de pré-enrichissement dans 9 mL de bouillon au tétrathionate additionné de vert brillant (TBG) et 0.1 mL dans 9 mL de bouillon Bouillon Rappaport-Vassiliadis au peptone de soja (RVS). Si le bouillon RVS est remplacé par le bouillon SC transférer 1.0 mL de la culture de pré-enrichissement dans 9 mL de bouillon SC.

6.3.2 Incuber les bouillons RVS et TBG à 42.5 °C pour une période de 24 ± 2 heures. Si le bouillon SC est utilisé, incuber le bouillon pendant 24 ± 2 heures à 35°C.

6.3.3 Enrichissement en milieu sélectif

6.3.3.1 Cette approche est complémentaire à ce qui est décrit à la section 6.2.3., et permet uneplus grande flexibilité analytique.

6.3.3.2 Les bouillons d'enrichissement sélectifs peuvent être réfrigérés (2 à 8 °C) jusqu'à 72 heures (e.g. après la fin de semaine).

6.4 Isolement sur gélose sélective

6.4.1 Mélanger au vortex ou remettre en suspension les bouillons. Ensemencer par épuisement chacun des bouillons sélectifs sur des géloses sélectives afin de pouvoir obtenir des colonies isolées. Sélectionnez au moins deux des géloses du Groupe 1 (Section 5). D'autres géloses appartenant au Groupe 2 peuvent être utilisées mais seulement en concomitance avec les géloses du Groupe 1.

6.4.2 Incuber les boîtes de gélose à 35 °C pendant 24 h ± 2 h. S'il n'y a pas de colonies indiquant la présence de Salmonella sur la gélose BS, incuber les boîtes pendant 24 h ± 2 h de plus.

6.4.3 Après l'incubation, rechercher dans les boîtes des colonies indiquant la présence de Salmonella. Sur la gélose BGS, la couleur des colonies caractéristiques de Salmonella varie habituellement du rose au fuchsia, et le milieu qui les entoure est rouge. Sur la gélose BS, les colonies sont noires et peuvent avoir un reflet métallique ou non; si la période d'incubation se prolonge, le milieu qui les entoure noircit progressivement à cause de la production de H2S. Les Salmonella atypiques peuvent afficher une faible croissance sur les milieux utilisés, et peuvent avoir une apparence différente de ce qui est décrit ci-dessus. Sur la gélose Brillance Salmonella, les Salmonella sont d'une couleur pourpre brillante alors que les autres bactéries entériques sont bleues ou incolores. Suivre les instructions du fabricant losrque des géloses du Groupe 2 sont utilisées ou lors de l'identification des isolats présumés de Salmonella.

6.4.4 Lorsque des colonies présumées sont bien isolées et sont de taille suffisante, poursuivre l'identification biochimique en utilisant 1 à 3 colonies par type de gélose (ou davantage si l'on désire identifier plusieurs sérotypes de Salmonella etc.) . De façon simultanée , purifier les isolats tel que décrit à la section 6.5.

Lorsque les colonies ne sont pas bien isolées ou sont de petite taille (possiblement un sérotype à croissance lente), purifier les colonies présumées par ensemencement sur une gélose MacConkey tel que décrit à la section 6.5 et poursuivre.

6.4.5 L'absence de colonies présumées (typiques ou atypiques en apparence) sur les géloses indique que l'unité d'échantilonnage ou les unités d'échantillonnage analysés composite ne contiennent pas de Salmonella spp. pouvant croître sur les milieux utilisées.

6.5 Purification

6.5.1 Ensemencer par épuisement les colonies présumées sur des boîtes de gélose de MacConkey pour les purifier.

6.5.2 Incuber les boîtes de gélose à 35 °C pendant 24 h ± 2 h.

6.5.3 Les colonies typiques de Salmonella sont lactose-négatives et incolores sur ce milieu. Toutefois, celles des biotypes lactose-positifs sont roses.

6.6 Sélection biochimique

6.6.1 Utiliser une aiguille d'ensemencement stérile pour déposer des colonies présumées dans les milieux biochimiques énumérés au Tableau II. Incuber les milieux biochimiques pendant 18 à 24 h à 35 °C. Ne pas fermer les tubes complètement.

6.6.2 On peut utiliser des trousses de diagnostic commerciales pour obtenir les profils biochimiques détaillés d'isolats bactériens.

6.6.3 Si aucun des isolats d'une unité d'échantillonnage particulière n'indique la présence possible de Salmonella, il faut considérer que l'unité d'échantillonnage en est exempte. Si l'on soupçonne la présence de Salmonella, il faut passer à l'épreuve sérologique.

6.6.4 Si l'épreuve sérologique n'est pas effectuée dans les 72 h suivantes, ensemencer des isolats présumés sur des pentes de gélose nutritive et incuber à 35 °C pendant 24 h ± 2 h.

6.6.5 Autres épreuves biochimiques (Facultatif)

D'autres épreuves biochimiques ou des trousses d'identification (ex. O.B.I.S.) peuvent être utilisées de façon concomitante avec celles énumérées ci-dessus.

6.7 Identification sérologique

6.7.1 Épreuve avec antisérum somatique (O) polyvalent ou trousses d'agglutination au latex

Suivre les instructions du fabriquant en utilisant un inoculum de moins de 72 heures.

6.7.2 Épreuve avec antisérum somatique (O) de groupage (Facultatif)

Il est parfois avantageux d'éprouver des cultures présumées de Salmonella à l'aide d'antisérums de groupage somatique. Plusieurs Salmonella d'origine alimentaire appartiennent aux groupes somatiques B, C D ou E. Néammoins, il est important de reconnaître qu'à moins d'avoir utilisé un jeu complet d'antisérums de groupage qu'il est possible de n'avoir pu identifier un Salmonella appartenant à un sérotype peu commun.

6.7.3 Épreuve avec des antisérums Flagellaires (H) (Facultatif)

Lorsqu'il n'est pas possible d'avoir recours aux services d'un centre de référence en typage sérologique, les isolats de Salmonella devraient être identifiées de façon plus approfondie en utilisant l'épreuve à l'antisérum polyvalent H en conformité avec la procédure décrite dans "Microorganisms in Food" (7.12).

7. RÉFÉRENCES

7.1 Andrews, W.H. 1989. Methods for recovering injured "classical" enteric pathogenic bacteria (Salmonella, Shigella, and enteropathogenic Escherichia coli) from foods. Chapter 3. In: B. Ray (ed.) Injured, Index and Pathogenic Bacteria, CRC Press, Boca Raton, FL. pp. 55-113.

7.2 Association of Official Analytical Chemists (AOAC) International. 1995. FDA Bacteriological Analytical Manual, Eighth Edition. AOAC International, Arlington, VA.

7.3 D'Aoust, J.-Y. 1977. Effect of storage conditions on the performance of bismuth sulfite agar. J. Clin. Microbiol. 5: 122-124.

7.4 D'Aoust, J.-Y., 1981. Update on preenrichment and selective enrichment conditions for detection of Salmonella in foods. J. Food Prot. 44:369-374.

7.5 D'Aoust, J.-Y. 1984. Effective enrichment-plating conditions for detection of Salmonella in foods. J. Food Prot. 47:588-590.

7.6 D'Aoust, J.-Y. 1989. Salmonella. Chapter 9. In: M.P. Doyle (ed.). Foodborne Bacterial Pathogens, Marcel Dekker Inc., New York, NY. pp. 327-445.

7.7 D'Aoust, J.-Y., C. Maishment, D.M. Burgener, D.R. Conley, A. Loit, M. Milling and U. Purvis. 1980. Detection of Salmonella in refrigerated preenrichment and enrichment broth cultures. J. Food Prot. 43:343-345.

7.8 D'Aoust, J.-Y., H.J. Beckers, M. Boothroyd, A. Mates, C.R. McKee, A.B. Moran, P. Sado, G.E. Spain, W.H. Sperber, P. Vassiliadis, D.E. Wagner, and C. Wiberg. 1983. ICMSF Methods Studies. XIV. Comparative study on recovery of Salmonella from refrigerated preenrichment and enrichment broth cultures. J. Food Prot. 46:391-399.

7.9 D'Aoust, J.-Y., A.M. Sewell and D.W. Warburton. 1992. A comparison of standard cultural methods for the detection of foodborne Salmonella. Int. J. Food Microbiol. 16: 41-50.

7.10 D'Aoust, J.-Y., A.M. Sewell and P. Greco. 1993. Detection of Salmonella in dry foods using refrigerated preenrichment and enrichment broth cultures: interlaboratory study. J. of AOAC Int. 76:814-821.

7.11 D'Aoust. J.-Y., A.M. Sewell and C. McDonald. 1995. Recovery of Salmonella spp. from refrigerated preenrichment cultures of dry food composites. J. AOAC Int. 78: 1322-1324.

7.12 International Commission on Microbiological Specifications for Foods (ICMSF). 1978. Microorganisms in Foods 1. Their significance and methods of enumeration. Second edition. University of Toronto Press, Toronto, ON.

7.13 ICMSF. 1986. Microorganisms in Foods 2. Sampling for microbiological analysis: Principles and specific applications. Second edition. University of Toronto Press, Toronto, ON.

7.14 ICMSF. 2005. Microorganisms in Foods. Volume 6. Microbial Ecology of Food Commodities. Second edition. Kluwer Academic/Plenum Publishers. New York.

7.15 Health Canada. 2008. Health Products and Food Branch Standards (HPFB) and Guidelines for Microbiological Safety of Food - Interpretive Summary. In: Volume 1. The Compendium of Analytical Methods. Ottawa. http://www.hc-sc.gc.ca/fn-an/res-rech/analy-meth/microbio/index_e.html

7.16 ICMSF. 2002. Microorganisms in Foods. Volume 7. Microbiological Testing in Food Safety Management. Kluwer Academic/Plenum Publishers. New York.

7.17 Ponka, A., Y. Andersson, A. Siitonen, B. de Jong, B, M. Jahkola, O. Haikala, A. Kuhmonen, and P. Pakkala. 1995. Salmonella in alfalfa sprouts. Lancet-British-Edition. 345(8947): 462-463.

7.18 Gill, C. J., W. E. Keene, J. C. Mohle Boetani, J. A. Farrar, P. L. Waller, C. G. Hahn, and P. R. Cieslak. 2003. Alfalfa seed decontamination in a Salmonella outbreak. Emerging Infectious-Diseases. 9(4):474-479.

7.19 Liao, C.-H., and W. F. Fett. 2003. Isolation of Salmonella from Alfalfa Seed and demonstration of Impaired Growth of Heat-Injured Cells in Seed Homogenates. Int. J. Food Microbiol. 82:245-253.

7.20 Inami, G. B., S. M. C. Lee, R. W. Hogue, and R. A. Brenden. 2001. Two Processing Methods for the Isolation of Salmonella from Naturally Contaminated Alfalfa seeds. J. Food Prot. 64(8):1240-1243.

7:21 Dong, Y., A. L. Iniguez, B. M. M. Ahmer, and E. W. Triplett. 2003. Kinetics and Strain Specificity of Rhizophere and Endophytic Colonization by Enteric Bacteria on Seedlings of Medicago sativa and Medicago truncatula. Appl. Environ. Microbiol. 69(3):1783-1790.

7.22 Jaquette, C. B., L. R. Beuchat, and B. E. Mahon. 1996. Efficacy of Chlorine and Heat Treatment in Killing Salmonella stanley Inoculated onto Alfalfa Seeds and Growth and Survival of the Pathogen During Sprouting and Storage. 62(6):2212-2215.

7.23 Monteville, R., and D. Schaffner. 2005. Monte Carlo Stimulation of Pathogen Behavior During the Sprout Production Process. Appl. Environ. Microbiol. 71(2):746-753.

7.24 Gandhi, M., S. Golding, S. Yaron, and K. R. Matthews. 2001. Use of Green Fluorescent Protein Expressing Salmonella Stanley to Investigate Survival, Spatial Location, and Control on Alfalfa Sprouts. J. Food Prot. 64(12):1891-1898.

7.25 International Organization for Standardization (ISO). 2002. ISO 6579:2002. Microbiology of Food and Animal Feeding Stuffs -- Horizontal Method for the Detection of Salmonella, International Organization for Standardization, Geneva, ISO Central secretariat. CP 56 CH-1211. Geneva 20. Switzerland.

7.26 ISO. 2002. ISO 6579:2002/Amd 1:2007. Annex D: Microbiology of food and animal feeding stuffs - Detection of Salmonella spp. in animal faeces and in environmental samples from the primary production stage. International Organization for Standardization. Geneva . ISO Central secretariat. CP 56 CH-1211. Geneva 20. Switzerland

7.27 ISO. 1993. ISO 6579:1993. Microbiology - General Guidance on Methods for the Detection of Salmonella, International Organization for Standardization, Geneva, Geneva, ISO Central secretariat. CP 56 CH-1211. Geneva 20. Switzerland.

7.28 ISO. 2001. ISO 6785:2001. Microbiology of Food and Animal Feeding Stuffs, Milk and milk products -- Detection of Salmonella sp. International Organization for Standardization, Geneva, Geneva, ISO Central secretariat. CP 56 CH-1211. Geneva 20. Switzerland.

7.29 ISO. 1995. ISO 6340:1995. Water quality - Detection and enumeration of Salmonella. International Organization for Standardization, Geneva, Geneva, ISO Central secretariat. CP 56 CH-1211. Geneva 20. Switzerland.

7.30 Warburton, D.W., B. Bowen, A. Konkle, C. Crawford, S. Durzi, R. Foster, C. Fox, L. Gour, G. Krohn, et al. 1994. A comparison of six different plating media used in the isolation of Salmonella. Int. J. Food Microbiol. 22:277-289.

Annexe A

PROCÉDURE POUR L'ANALYSE DE GRAINES UTILISÉES POUR LA PRODUCTION DE GERMES

Analyse des graines d'alfalfa et autres

L'expérience au laboratoire a démontré que la probabilité de récupérer des Salmonellae de graines sèches intactes, telles que les graines de luzerne, de radis, de trèfle, de moutarde etc. est très faible lorsque la méthode de culture normalisée est utilisée (Données non publiées ACIA et SC, 7.17, 7.20). De plus, les résultats de recherche indiquent que les microorganismes pathogènes sont répartis de façon hétérogène, à de faibles concentrations (0.3 à 0.9 cellule par 25 g), ont été sévèrement endommagés durant la production ou l'entreposage, et se logent souvent à l'intérieur de la graine elle-même (7.18, 7.19, 7.21).

Il est possible cependant d'améliorer cette probabilité en faisant germer les graines dans des conditions stériles, car la germination agit de façon très efficace comme procédure d'enrichissement (Données non publiées ACIA et SC, 7.20, 7.22, 7.23, 7.24)

Procédure pour la germination des graines

Peser aseptiquement 125 g de graines dans un contenant stérile et ajouter de l'eau distillée stérile jusqu'à ce que le niveau dépasse les graines d'environ 1 pouce. Recouvrir de façon stérile et incuber à 30 °C pendant 3 jours.

Le premier volume d'eau ajouté sera absorbé après environ deux heures. Ajouter encore de l'eau pour rétablir le niveau. Continuer de surveiller le niveau d'eau pendant le reste de la période d'incubation et en rajouter si nécessaire.

Après 3 jours d'incubation, les enveloppes devraient avoir éclaté et une certaine germination devrait être apparente. Il faut plus de temps à certaines graines qu'à d'autres pour atteindre la germination complète, mais 3 jours devraient être suffisants dans la plupart des cas. Peser de façon stérile 125 g (ou le volume d'échantillon recommandé qui peut varier en fonction du type d'échantillon e.g. collecte de données ou enquête) de la "bouillie" germée (c.-à-d. mélange de graines germées et d'eau) et ajouter à 1 125 mL de bouillon nutritif pour une pré-incubation à 35°C pour une période de 18 à 24 heures. Exécuter la méthode MFHPB-20 à partir de la section 6.3.

TABLEAU I. Protocole d'enrichissement en milieu non sélectif (pré-enrichissement)

Type de produit	Nombre d'unités d'échantillonnage	Préparation de l'unité d'analyse à partir de chaque unité d'échantillonnagea
Pâtes alimentaires p.  ex., spaghetti, nouilles.	5	Mettre 25 g en suspension dans 225 mL de bouilln nutritif ou d'EPT et mélanger.  On peut également mélanger le produit sec à vitesse réduite pour obtenir du matériel en fines particules pour l'analyse.
Noix de coco	5	Mettre 25 g en suspension dans 225 mL de bouillon nutritif ou d'EPT et mélanger.
Confiseries
a.  Chocolat et cacao	10	Mettre 25 g en suspension dans 225 mL de milieu au lait écrémé et mélanger.
b.  Bonbons	5	Mettre 25 g en suspension dans 225 mL de milieu au lait écrémé et mélanger.
Produits laitiers
a.  Fromage	5	Mettre 25 g en suspension dans 225 mL de bouillon nutritif ou d'EPT et mélanger.
b.  Lait de consommation	5	Ajouter 25 mL à 225 mL de solution aqueuse de vert brillant.
c.  Crème glacée	5	Mettre 25 g en suspension dans 225 mL de solution aqueuse de vert brillant.
d.  Produits en poudre p.  ex., lactosérum, babeurre	5	Ajouter lentement 25 g à 225 mL de solution aqueuse de vert brillant stérile et laisser la poudre s'imbiber.  Ne pas mélanger.
e.  Lait écrémé en poudre	20	Ajouter lentement 25 g à 225 mL de solution aqueuse de vert brillant stérile et laisser la poudre s'imbiber. Ne pas mélanger.
Ovoproduits liquides	10	Mettre 25 g en suspension dans 225 mL de bouillon nutritif ou d'EPT et mélanger.
Cuisses de grenouilleb	5	Déposer 25 g dans 225 mL de bouillon nutritif ou d'EPT.
Viandes	5	Mettre 25 g en suspension dans 225 mL de bouillon nutritif ou d'EPT et mélanger.
Volaille a.  Crue (Volaille entière ou en morceaux emballés $ 100g)	5	Placer la volaille décongelée ou fraîche, les dégoulinades et les abats (le cas échéant) dans un sac de plastique stérile résistant.  Ajouter 1,0 litre de bouillon nutritif ou d'EPT et agiter vigoureusement pour faire en sorte que toutes les surfaces de l'échantillon viennent en contact avec le bouillon. Verser le bouillon dans un contenant stérile pour l'incubation.
b. Abats (emballage de tout format) et pièces crues (emballages de # 100 g)	5	Mettre 25 g en suspension dans 225 mL de bouillon nutritif ou d'EPT et mélanger.
C. Cuite	5	Mettre 25 g en suspension dans 225 mL de bouillon nutritif ou d'EPT et mélanger.
Aliments préparés p.  ex., pâtés à la viande, repas préparés	5	Combiner 25 g de chaque aliment composant le mets (le cas échéant) en une seule unité d'analyse; ajouter 9 volumes de bouillon nutritif ou d'EPT et mélanger.
Épices et assaisonnements	10	Mettre 25 g en suspension dans 225 mL de bouillon nutritif ou d'EPT et bien mélanger.  Le rapport épice/milieu devrait être de 1:10 (p/v).  Cependant, il faut prévoir un rapport plus élevé dans le cas des épices qui pourraient avoir un effet bactéricide et de celles qui absorbent une importante partie du bouillon (Tableau III).  Dans le cas des oignons et de l'ail, utiliser du bouillon trypticase‑soja (peptone trypsique) contenant du K2SO3 à 0,5 % (p/v).
Graines utilisées pour la production de germes	5	Voir l'Annexe A.
Levure	5	Mettre 25 g en suspension dans 225 mL de bouillon nutritif ou d'EPT et bien mélanger.
Aliments non énumérés ci-dessus	5	Mettre 25 g en suspension dans 225 mL de bouillon nutritif ou d'EPT et bien mélanger le cas échéant

a)  Lorsque le format d'emballage offert au consommateur est de 100g (mL) ou moins, l'unité d'échantillonnage sera constitué de plusieurs emballages.

TABLEAU II. Épreuves biochimiques déterminantes

Milieu	Réaction	Observation	Réaction typique de Salmonella
Gélose aux trois sucres et au fer (TSI)	Utilisation du lactose ou du sucrose	Réaction positive : Pente jaune Réaction négative : La couleur de la pente ne change pas.	Négative (certains sérovars peuvent utiliser un substrat ou les deux).
	Utilisation du dextrose	Réaction positive : Culot jaune avec ou sans poches de gaz Réaction négative : La couleur du culot ne change pas.	Positive
	Production de H2S	Réaction positive : Noircissement du culot ou de la pente Réaction négative : Aucun noircissement	Positive (possibilité de dégagement lent de H2S.  La réaction H2S. peut être inhibée en présence de souches lactose-positives ou sucrose-positives. Certains serovars ne produisent pas de  H2S.)
	Formation de gaz	Réaction positive : Poches de gaz dans le milieu Réaction négative : Absence de poches de gaz	Positive (Certains serovars sont anaérogènes)
Gélose lysine‑fer (LIA)	Production de H2S	Réaction positive : Noircissement du culot ou de la pente Réaction négative : Aucun noircissement	Positive (Certains serovars ne produisent pas de  H2S )
	Lysine‑décarboxylase	Réaction positive : Le culot demeure pourpre. Réaction négative : Le culot vire au jaune.	Positive (Certains serovars sont négatifs à l'épreuve de la lysine-décarboxylase)
	Lysine-désaminase	Réaction positive : La pente vire au rouge vin. Réaction négative : La couleur de la pente ne change pas.	Négative
Gélose à l'urée de Christensen	Production d'uréase	Réaction positive : La pente vire au rose/rouge Réaction négative : La couleur de la pente ne change pas.	Négative

TABLEAU III. Rapport recommandé entre les épices et les assaisonnements et le bouillon de pré-enrichissement (p:v) ^a

 

^a) Pour les épices et assaisonnements seulement: Le ratio est donné en poids / volume ( p:v), de telle sorte que 1:10 signifie que 1 g d'épice est ajouté à 10 mL de bouillon d'enrichissement. Ainsi, pour un unité d'chantillonnage de 25 g, 250 mL de bouillon d'enrichissement seront ajoutés.