7.5.1.1 Dans les boîtes préparées en double et qui ont été comptées, choisir comme il suit un certain nombre de colonies de chaque type pour vérifier la pureté de la culture :

Lorsque le dénombrement total par type de colonie sur toutes les boîtes d'une dilution est inférieur à cinq, prélever toutes les colonies de ce type.

Lorsque le dénombrement total par type de colonie sur toutes les boîtes d'une dilution est égal ou supérieur à cinq, prélever au hasard cinq colonies de ce type.

7.5.1.2 Si les colonies ont une morphologie typique et qu'elles sont bien isolées, procéder tel que décrit au point 7.5.1.5. Sinon, ensemencer en stries chaque colonie choisie sur un milieu non sélectif comme une gélose BA, NA ou TSA afin d'obtenir des colonies distinctes.

7.5.1.3 Incuber à 35 °C pendant 24 ± 2 h.

7.5.1.4 Si les colonies ont une morphologie typique et qu'elles sont bien isolées, procéder tel que décrit au point 7.5.1.5. Sinon, effectuer un frottis à partir de la croissance de chaque isolat sur le milieu non sélectif et colorer avec un colorant simple (violet de cristal, par exemple). Examiner au microscope pour déceler la présence de coques. Si un isolat n'est pas pur, choisir une autre colonie mentionnée à l'étape 7.5.1.2 et répéter les étapes d'isolation des colonies ci-dessus.

7.5.1.5 Transférer l'inoculum de chaque colonie dans une éprouvette distincte de bouillon de cerveau et de cour (BHI).

7.5.1.6 Incuber les éprouvettes de bouillon de BHI ensemencées à 35 °C pendant 18-24 h et observer s'il y a croissance.

7.5.1.7 Garder les cultures de bouillon de BHI.

7.5.2.1 Transférer 0,2 mL de chaque culture de bouillon de BHI dans des éprouvettes stériles de 13 x 100 mm contenant 0,5 mL de plasma homologué pour l'épreuve de la production de coagulase. Mélanger soigneusement.

7.5.2.2 Incuber les éprouvettes à une température de 35 °C et examiner après 1 h et 4 h. Ne pas agiter les éprouvettes durant l'incubation. Incuber les éprouvettes négatives toute la nuit à la température de la pièce et vérifier de nouveau.

7.5.2.3 On considère que la présence d'un caillot ferme qui ne bouge pas lorsque l'on penche l'éprouvette (réaction coagulase 4+) constitue un résultat positif pour la présence de S. aureus. Aucune confirmation supplémentaire n'est nécessaire.

Si la réaction à la coagulase est de 3+ , 2+ ou 1+, il faut procéder à au moins deux des épreuves de confirmation indiquées au point 7.5.3. Si deux de ces épreuves donnent un résultat positif, on considère que l'isolat est constitué de S. aureus.

Si aucun caillot n'est observé, le résultat est considéré comme étant négatif pour S.aureus. Aucune confirmation n'est nécessaire.

Se référer à la Fig. 2 pour une visualisation des résultats de la coagulase.