Détection des Listeria spp dans les aliments et les échantillons environnementaux par la méthode VIDAS Listeria™

Méthode de la DGPS MFHPB-29
octobre 2011

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Direction Générale des Produits de Santé et des Aliments

Don Warburton, Ann Boville et Anne Sewell
Bureau des dangers microbiens, Direction des Aliments
Repère postal : 2204E
Santé Canada, Ottawa ON K1A 0K9

Courriel : micro_methods_committee@hc-sc.gc.ca

1. Application

Cette méthode s'applique à la détection des Listeria spp. dans les aliments afin de déterminer s'il y a conformité avec les articles 4 et 7 de la Loi sur les aliments et drogues. Cette méthode a été validée pour l'utilisation avec les viandes crues, les poissons crus et crustacés, les poissons et fruits de mer thermiquement traités, les produits à base de fruits et de légumes, les produits laitiers (à l'exclusion du yaourt) , et les échantillons environnementaux. Un nombre insuffisant de données de validation on été reçu pour les oeufs crus, les aliments (viande et volaille) prêts-à-manger, et les aliments divers. Cette méthode révisée remplace la méthode MFHPB-29 datée de février 2011.

Note : Même si cette méthode n'est approuvée que pour certains produits alimentaires, énumérés ci-dessus, il peut-être assumé que cette méthode pourrait être utilisée avec d'autres produits alimentaires. Pour s'assurer que la méthode convient pour l'utilisation visée avec d'autres produits alimentaires, il est impératif que la méthode soit correctement validée avec ces autres produits selon les lignes directrices dans le Compendium des méthodes analytiques. Le cas échéant nous demandons de transmettre ces données de validation au Comité des Méthodes de Microbiologie afin que nous puissions réviser la portée d'application de la méthode à la lumière de ces nouvelles données à condition que celles-ci répondent aux critères d'acceptabilité du CMM (voir Élaboration de méthodes dans le volume 1 du Compendium de méthodes.)

2. Description

La méthode VIDAS Listeria a été homologuée par l'Association Française de Normalisation (AFNOR) le 17 juin 1994 en tant que méthode rapide d'analyse pour tous les produits alimentaires humains. Cette homologation a été obtenue en accord avec la méthode de référence décrite dans la norme française NF EN ISO 11290-1 (8.3). La méthode a également été homologuée en mai 1999 comme Méthode Officielle Nº 999.06 par l'Association of Analytical Chemists (AOAC). La méthode a été modifiée par Warburton et coll. (8.4) afin de permettre l'utilisation d'un bouillon unique (le bouillon Palcam) comme milieu de pré-enrichissement pour tous les échantillons alimentaires et environnementaux. Par la suite, cette méthode a été évaluée lors d'une étude comparative impliquant des laboratoires de SC, de l'ACIA et des laboratoires privés (Warburton et coll., DGPSA, données non publiées).

3. Principe

L'essai VIDAS LIS est un test d'immuno-analyse enzymatique par fluorescence à utiliser sur le système VIDAS pour la détection qualitative des Listeria spp. La surface interne du cône, un dispositif jetable semblable à un embout de pipette, est recouverte par des anticorps anti-Listeria durant la production.

La configuration de l'essai VIDAS LIS empêche les réactions non-spécifiques avec le cône. Tous les réactifs nécessaires à un essai sont contenus dans une cartouche scellée à chambres multiples.

L'appareil VIDAS effectue toutes les étapes de l'analyse de façon séquentielle et automatique. L'échantillon est inoculé dans la cartouche de réactifs et subit ensuite un cycle d'aspiration /refoulement d'une durée déterminée dans le cône. Les antigènes Listeria présents dans l'échantillon se fixent sur les anticorps monoclonaux anti-Listeria fixés sur la paroi du cône.  La partie non fixée de l'échantillon est éliminée par lavage. Par la suite, des anticorps conjugués à la phosphatase alcaline sont aspirés/refoulés dans le cône et réagissent avec les complexes antigène-anticorps de Listeria déjà fixés sur la paroi du cône. Le conjugué non fixé est éliminé par lavage.

Le substrat fluorescent, soit le 4-méthyl-umbelliferyl phosphate, est ensuite aspiré/refoulé dans le cône et il y est transformé par l'enzyme du conjugué en un produit fluorescent, le 4-méthyl-umbelliferone. L'intensité de la fluorescence est alors mesurée à 450nm.

VIDAS LIS™ est une marque de commerce déposée de bioMérieux.

4. Définitions

Voir l'annexe A du volume 2.

5. Prélèvement des échantillons

Voir l'annexe B du volume 2.

6. Matériel et équipements spéciaux

Les milieux suivants (3-7) sont disponibles commercialement et doivent être préparés et stérilisés selon les instructions du fabricant. Voir également l'annexe G du volume 2 et la référence 8.1 pour la formulation des milieux individuels.

Note : Si l'analyste utilise des variantes des milieux indiqués ici (qu'il s'agisse d'un produit disponible dans le marché ou fabriqué à partir d'ingrédients), il incombe à l'analyste ou au superviseur du laboratoire d'en assurer l'équivalence.

1. La trousse d'essai VIDAS Listeria (ref. 30 700): contient les réactifs nécessaires à l'analyse de 60 échantillons, y compris les standards et les contrôles. La trousse est disponible chez bioMérieux Canada, Inc., 4535 Dobrin, St-Laurent, Québec H4R 2L8, Tél : (514) 336-7321, Fax : (514) 336-6450.
2. Un système VIDAS 30 de grande capacité ou un miniVIDAS à capacité réduite.
3. Bouillon Palcam
4. Bouillon UVM 2
5. Gélose Palcam (ou gélose équivalente)
6. Gélose Oxford (ou gélose équivalente)
7. Géloses chromatogènes (facultatif):
   • Géloses Rapid L. mono (Laboratoires Bio Rad)
   • Géloses pour Listeria selon Ottaviani & Agosti ( Aloa )
8. Une pipette calibrée pour distribuer 500 μl avec embouts jetable
9. Stomacher et sacs à stomacher, mélangeur ou équivalent
10. Bain-marie (95-100° C) ou un système équivalent
11. Incubateurs capables de maintenir 30°C et 35°C

Note : Il incombe à chaque laboratoire de s'assurer que les incubateurs ou les bains-marie soient maintenus à la température recommandée. Lorsqu'on recommande 35 °C dans le texte de la méthode, l'incubateur peut être à 35 +/‑1,0 °C.  De même, des  températures plus basses à 30 ou 25 peuvent être à +/‑1,0 °C. Toutefois, lorsqu'on recommande des températures plus élevées, comme 43 ou 45,5 °C, il est impératif de maintenir la température des incubateurs ou des bains-marie à +/‑ 0,5 °C de variation. Une température plus élevée peut être létale pour les micro-organismes qu'on cherche à isoler.

7. Procédure

7.1 Manipulation des unités d'échantillonnage

7.1.1 Avant l'analyse au laboratoire, sauf dans le cas des aliments stables à température de la pièce, garder les unités d'échantillonnage au réfrigérateur ou au congélateur, selon la nature du produit. Faire dégeler les échantillons congelés dans un réfrigérateur, ou pendant une période et à une température qui empêchent la croissance ou la mort des micro-organismes.

7.1.2 Analyser les unités d'échantillonnage le plus tôt possible après leur arrivée au laboratoire.

7.2 Préparation pour l'analyse

7.2.1 Avoir à sa disposition du bouillon Palcam stérile.

7.2.2 Nettoyer la surface de travail à l'aide d'un désinfectant

7.3 Préparation de l'échantillon

Pour assurer que l'unité d'analyse soit vraiment représentative, agiter les liquides ou les solides fluides jusqu'à ce que le contenu soit homogène. Dans le cas d'un solide, prélever des portions à différents endroits de l'unité d'échantillonnage.

7.4 Enrichissement primaire

Ajouter 25 g ou ml de l'aliment (l'unité d'analyse) à 225 ml de bouillon Palcam dans une jarre de mélangeur ou dans un sac à stomacher. Dans le cas des échantillons composés.maintenir un ratio d'une partie d'échantillon pour 9 parties de bouillon Palcam ( voir la Politique sur la présence de Listeria monocytogenes dans les aliments prêts-à-manger). Presser les écouvillons environnementaux dans 10 ml d'agent neutralisant et ajouter cet échantillon à 90 ml de bouillon Palcam. Mélanger au broyeur, au stomacher ou au vortex selon les besoins pour obtenir un mélange complet et incuber à 35°C pendant 26 heures. Les éponges environnementales peuvent être ajoutées à 100 ml de bouillon Palcam ou être regroupées jusqu'à un maximum de 10 éponges avec 100 ml de bouillon Palcam par éponge (voir MFLP-41).

7.5 Enrichissement secondaire

7.5.1 Agiter le bouillon Palcam suffisamment pour le mélanger et laisser déposer les grosses particules d'aliment. Transférer 1.0 ml de bouillon Palcam dans 9.0 ml de bouillon UVM 2. Incuber à 30° C pendant 26 (minimum) à 48 heures.

7.5.2 Réfrigération des cultures d'enrichissement secondaire (UVM2) - FACULTATIF

La réfrigération des cultures d'enrichissement secondaire (UVM 2) assure au laboratoire une productivité et une flexibilité analytique plus grandes. Les cultures UVM 2 obtenues le vendredi à partir d'échantillons analysés le mercredi ou jeudi précédent sont réfrigérées (4 à 10 °C) pendant la fin de semaine. Le lundi suivant, le contenu des cultures UVM 2 réfrigérées est remis en suspension. Procéder de la façon décrite en 7.3.3 et 7.6.

7.5.3 Après incubation, transférer 2 ml du bouillon d'enrichissement dans un tube à essai et chauffer le tube durant 15 +/- 2 minutes au bain-marie à 95-100 °C.  Laisser refroidir le tube et effectuer l'essai VIDAS LIS. Conserver le bouillon d'enrichissement restant entre 2-8 °C pour utilisation ultérieure de tests de confirmation à réaliser en cas d'essais VIDAS Listeria positifs.

7.6 Analyse

7.6.1 Sortir la trousse VIDAS LIS du réfrigérateur. Prélever les réactifs nécessaires à l'analyse et les laisser atteindre la température ambiante (minimum 30 minutes). Conserver les réactifs non utilisés à 2-8 °C.

7.6.2 Inscrire sur chaque cartouche, à l'endroit réservé à cet effet, le numéro d'identification de l'échantillon.

7.6.3 Suivre les instructions applicables à l'entrée des données sur le lot, l'échantillon, le standard et le contrôle, selon les instructions opérationnelles s'appliquant au système VIDAS utilisé (le système VIDAS 30 de grande capacité ou le miniVIDAS).

Note : Les composantes de différents lots ne peuvent être mélangées et ne peuvent être utilisées au delà de la date de péremption.

7.6.4 Lorsqu'un nouveau lot de trousse est utilisé, les spécifications (ou la courbe de calibration maîtresse du fabricant) doivent d'abord être entrées dans le système à l'aide de la carte d'entrée de lot incluse dans chaque trousse.

7.6.5 Le standard doit être étalonné au moins à tous les 14 jours et lorsqu'un nouveau lot de trousse est utilisé. Si un standard doit être testé, entrer "S1" pour l'identification de l'échantillon. Le standard doit être placé au début de la liste de travail, suivi par les contrôles C1 et C2. Le standard doit être effectué en double, les deux portant la même désignation S1, si cela doit être enregistré dans la mémoire.

7.6.6 Homogénéiser au vortex, les standards, les contrôles et les échantillons chauffés. A l'aide de la pipette, déposer 500 +/- 50 μl de standard, de contrôles et d'échantillon chauffé au centre du puits d'échantillon de la cartouche LIS. Il est essentiel de chauffer tout bouillon d'enrichissement durant 15 minutes à 95-100 °C et de le laisser refroidir à température ambiante avant d'effectuer l'essai sur le VIDAS.

7.6.7 Placer la cartouche LIS et le cône LIS dans le VIDAS au niveau des positions indiquées par la liste de travail. S'assurer que les étiquettes colorées, indiquant le code à trois lettres de l'essai, du cône et de la cartouche sont concordantes.

7.6.8 Commencer l'analyse tel qu' indiquée dans le manuel d'opération VIDAS. L'analyse sera complétée en approximativement 45 minutes.

7.6.9 Consulter la notice VIDAS LIS pour plus de détails.

7.7 Interprétation

Les tests dont la RFV (relative fluorescence value) est supérieure ou égale à 0.10 indiquent la présence présumée de Listeria spp dans l'échantillon.

7.8 Confirmation

7.8.1 Les résultats positifs présumés peuvent être, le cas échéant, confirmés par l'ensemencement et la confirmation du bouillon réfrigéré d'enrichissement secondaire selon les étapes décrites dans une méthode de culture tel que MFHPB-07 ou MFHPB-30.

Note : Si les résultats indiquent qu'aucune espèce de Listeria n'a été détectée, il est convenu que la présence de Listeria monocytogenes n'ait pas été révéléepuisqu'aucune espèce appartenant au genre Listeria ne fut détectée. Toutefois, si un résultat positif Listeria spp. est obtenu à partir d'un écouvillonnage environnemental, on doit présumer qu'il est possible que Listeria monocytogenes soit présente, sans égard au nombre de colonies présumées testées ou au nombre d'essais de confirmation supplémentaires réalisés. Pour les échantillons environnementaux, rapporter toutes les espèces de Listeria identifiées.

8. Références

• 8.1 Atlas, R.M. 1997. Handbook of Microbiological Media. Second edition. L.C. Parks (editor). CRC Press Inc.
• 8.2 NF EN ISO 11290-1. Méthode horizontale pour la recherche et le dénombrement de Listeria monocytogenes.
• 8.3 Pagotto, F., Hebert , K et J. Farber . 2011. Isolement de Listeria monocytogenes et autres Listeria spp. dans les aliments et échantillons environnementaux (MFHPB-30) Volume 2. Compendium des Méthodes. http://www.hc-sc.gc.ca/fn-an/res-rech/analy-meth/microbio/index-fra.php.
• 8.4 A.M. Sewell, Warburton, D. W., Boville, A., Daley, E. F. and Mullen, K. 2003. A.Comparison of the Health Products and Food Branch and the Enzyme Linked Fluorescent Assay Methods for the Isolation and Identification of Listeria spp. from Foods. Int. J. Food Micro. (81)2 :123-129.
• 8.5 Santé Canada, Direction générale des Produits de Sante et des Aliments. 2010. La Politique sur la présence de Listeria monocytogenes dans les aliments prêts-à-manger.
• 8.6 Warburton, D., Boville, A., Pagotto, F., Daley, E. et Chow, C. 2011. Isolement de Listeria monocytogenes et des autres Listeria spp. dans les aliments et les échantillons environnementaux à l'aide du bouillon palcam (MFHPB-07). Volume 2. Compendium des Méthodes. http://www.hc-sc.gc.ca/fn-an/res-rech/analy-meth/microbio/index-fra.php

Remerciements

Nous remercions les personnes suivantes pour leur assistance dans le développement de cette méthode :

• Cindy Chow et Sheila Davidson de SC, Ottawa
• Lorraine Gour, Ghislaine Bélanger et Gilles Brunelle de SC, Longueuil
• Yvon-Louis Trottier et Lyne Laflamme de l'ACIA, St-Hyacinthe
• Karen Jessett, George Huszczynski et Nelly Denis de l'ACIA, Mississauga
• Kim Hopkins, Silliker Labs, Toronto, Ontario
• et Karen Mullen, BioMerieux Canada, Scarborough, Ontario.