Isolement de Listeria monocytogenes et autres Listeria spp. dans les aliments et les échantillons environnementaux

Méthode de la DGPS MFHPB-30
avril 2011

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Direction Générale des Produits de Santé et des Aliments

Ottawa

Isolement de Listeria monocytogenes et autres Listeria spp. dans les aliments et les échantillons environnementaux

Franco Pagotto, Karine Hébert et Jeff Farber

Bureau des dangers microbiens
Direction des aliments
Santé Canada
Repère postal : 2204E
Ottawa (Ont.) K1A 0K9

Courriel: micro_methods_committee@hc-sc.gc.ca

1. Application

Cette méthode peut servir à l'isolement et l'identification de Listeria monocytogenes et les autres  Listeria spp afin d'établir s'il y a conformité avec les articles 4 et 7 de la Loi sur les aliments et drogues.   Cette méthode de culture est la méthode standard de référence de Santé Canada et peut-être utilisée pour les aliments et les échantillons environnementaux. Cette méthode révisée remplace la méthode MFHPB-30, datée de septembre 2010, le supplément à la méthode. MFHPB-30, daté de mars 2002 et l'annexe L (supplément à toutes les méthodes de détection de Listeria), datée de août 2005.

2. Principe

Cette méthode permet de déterminer la présence de Listeria spp viables dans des échantillons alimentaires ou environnementaux. Une portion de l'aliment ou de l'échantillon environnemental (éponge ou écouvillon) est enrichie dans un bouillon d'enrichissement primaire puis dans un bouillon d'enrichissement secondaire, est étalée sur une gélose sélective obligatoire et sur une autre gélose, et est incubée pendant une période donnée à une température déterminée. Il est convenu que les cellules viables de Listeria spp se multiplient dans ces conditions et forment des colonies visibles qu'il est possible d'identifier. La méthode est fondée sur les méthodes de Lovett (8.4, 8.5), de Hitchins (8.3) et de McClain et Lee (8.6), qui ont été modifiées à la lumière des données recueillies par Warburton et coll. (8.13, 8.14, 8.15) dans le cadre d'études comparatives. Dans la méthode modifiée, le bouillon Fraser modifié (8.7), le milieu au chlorure de lithium, phényléthanol et moxalactame (8.6) et les géloses Oxford (8.13), Oxford modifiée (8.7), et PALCAM (8.15) ont été ajoutés. La méthode a également été modifiée pour y inclure des géloses chromogéniques. Une étape obligatoire qui requiert l'ensemencement sur géloses sélectives du bouillon d'enrichissement LEB (formulation UVM1) après une incubation de 24 heures, en plus du transfert dans le bouillon Fraser modifié, a été ajoutée.

3. Définitions

Voir l'Annexe A du volume 2.

4. Prélèvement des échantillons

• 4.1 Voir l'Annexe B du volume 2.
• 4.2 Pour prélever les échantillons environnementaux, procéder de la façon décrite dans la méthode MFLP-41.

5. Matériel et équipements spéciaux

Les milieux et réactifs énumérés ci-après sont disponibles sur le marché et doivent être préparés et stérilisés selon les instructions du fabricant. Voir aussi l'annexe G du volume 2 pour la composition des milieux.

Bouillons de Listeria et géloses (les milieux de base et les suppléments sont disponibles dans le commerce)

1) Bouillon d'enrichissement de Listeria (LEB)

2) Bouillon Fraser modifié (MFB)

3) Gélose Oxford (OXA) - milieu d'ensemencement obligatoire

4) Géloses sélectives secondaires - l'utilisation de l'une d'entre elles est obligatoire

• - Gélose pour Listeria selon Ottaviani & Agosti (ALOA)
• - Gélose A.L. (Bio-Rad)
• - Gélose BBL CHROMagar Listeria (BD)
• - Gélose Brillance Listeria (OCLA ; Oxoid)
• - Milieu au chlorure de lithium, phényléthanol et moxalactame (LPM)
• - Gélose Oxford modifiée (MOX)
• - Gélose PALCAM (PAL)
• - Gélose RAPID'L.Mono (Bio-Rad)

5) Cultures témoins - utiliser des souches ATCC ou l'équivalent

• - Témoins positifs : Listeria monocytogenes, Listera ivanovii, Listeria innocua, Listeria grayi
• - Staphylococcus aureus et Rhodococcus equi - Facultatif

6) Stomacher, mélangeur ou l'équivalent, vortex

7) Microscope

8) Incubateurs pouvant maintenir des températures de 30°C et 35°C.

Milieux de confirmation et réactifs

9) Bouillon et gélose (TA) de tryptose

10) Bouillon et gélose de trypticase-soja additionnés de 0,6 % d'extrait de levure (TSB-YE et TSA-YE)

11) Gélose au sang de cheval ou au sang de mouton - recommandé pour l'épreuve de l'hémolyse

12) Milieu pour l'épreuve de motilité

13) Géloses ou bouillons de fermentation des glucides (mannitol, rhamnose et xylose).
Note : Il est possible d'effectuer les épreuves de fermentation au moyen de trousses  d'identification rapide (6.8.2).

Facultatif

14) Trousse d'identification rapide comme les trousses Vitek ou API Listeria (Bio Mérieux Vitek, spp) Micro-ID Listeria (Organon Teknika Corp.), AccuprobeMD pour Listeria (Gen-Probe; MFLP-88), O.B.I.S. Mono (Oxoid Biochemical Identification System; Oxoid) ou l'équivalent

15) Autres géloses nouvelles ou chromogéniques : Des géloses chromogéniques et d'autres nouvelles géloses d'isolement peuvent être utilisées mais seulement de concert avec les milieux obligatoires.

16) Gélose au sang de mouton - pour l'épreuve de CAMP

17) Trousse d'agglutination au Latex (par exemple, la trousse Oxoid Listeria Test)

18) Antisérum de Listeria monocytogenes (Denka Seiken)

19) Solutions pour la coloration de Gram

20) Peroxyde d'hydrogène à 3 % - pour l'épreuve de catalase

21) Produits biochimiques - dextrose, esculine, maltose, "-méthyl-D-mannoside

22) Disques de bêta-lysine (Remel)

6. Marche à suivre

Analyser chaque unité d'échantillonnage séparément ou regrouper les unités d'analyse en composites selon le plan d'échantillonnage présenté dans la politique de Listeria. Maintenir un ratio d'une partie d'échantillon pour 9 parties de bouillon d'enrichissement stérile. Des données sur la distribution de Listeria peuvent être obtenues en analysant séparément chaque unité d'analyse. Effectuer l'analyse conformément aux instructions suivantes :

6.1 Manipulation des unités d'échantillonnage

6.1.1

Les unités d'échantillonnage doivent être conservées au réfrigérateur ou au congélateur, selon la nature du produit, jusqu'au moment de l'analyse sauf dans le cas des aliments pouvant être conservés à la température de la pièce pour une longue période de temps. Faire dégeler les échantillons congelés au réfrigérateur ou pendant une période et à une température qui empêchent la croissance ou la mort des microorganismes.

6.1.2

Analyser les unités d'échantillonnage aussitôt que possible après leur arrivée au laboratoire.

6.2 Préparation de l'analyse

6.2.1

Avoir sous la main du bouillon d'enrichissement de Listeria (LEB) stérile, préalablement chauffé à 30 ± 1°C.

6.2.2

Nettoyer la surface de travail avec un désinfectant.

6.3 Préparation de l'échantillon

Pour obtenir une unité d'analyse représentative, agiter les liquides ou les matières fluides jusqu'à homogénéité. Si l'unité d'échantillonnage est un solide, constituer l'unité d'analyse en prélevant des portions à plusieurs endroits.

6.4 Méthode d'enrichissement (voir la figure 1)

Échantillons environnementaux : Ajouter 100 ml de LEB à une éponge ou un écouvillon de grande taille, ou 100 ml de LEB par éponge à un composite comportant jusqu'à 10 éponges (voir MFLP-41) Déposer les petits écouvillons (par exemple, un coton-tige) dans 10 ml de LEB ou ajouter 10 ml de LEB par écouvillon à un composite comportant jusqu'à 10 écouvillons.

Échantillons alimentaires: Ajouter 25 g ou ml d'aliment (unité d'analyse), à 225 ml de LEB dans le bocal d'un mélangeur ou dans un sac Stomacher. Dans le cas des échantillons composites, les unités analytiques peuvent être combinées jusqu'à concurrence de 125g ou ml (par exemple, 125g ou ml d'aliment à 1125 ml de LEB). Si des unités d'analyses différentes sont requises, maintenir un ratio de 1 portion d'échantillon pour 9 portions de LEB.

Pour les échantillons environnementaux et alimentaires, bien mélanger ou broyer pour homogénéiser. Le LEB ensemencé peut être incubé dans le sac Stomacher ou dans tout autre contenant stérile. Incuber le LEB ensemencé à 30°C pendant 48 heures.

6.4.1 Réfrigération du bouillon d'enrichissement (LEB) incubé - Facultatif

6.4.1.1

Cette approche permet la réfrigération du bouillon incubé jusqu'à 4 jours et une plus grande flexibilité.

6.4.1.2

Bien mélanger après la réfrigération avant d'effectuer l'étape 6.5.

6.5 Enrichissement sélectif

6.5.1

Après 24 et 48 heures d'incubation, mélanger le LEB manuellement ou au vortex.  Ensemencer 10 ml de bouillon Fraser modifié (MFB) avec 0,1 ml de LEB. Incuber à 35°C pendant 24 à 26 heures. En plus, après l'incubation 24 heures du LEB (au même moment où le transfert du LEB au MFB est effectué), effectuer l'étape 6.6, et ensemencer le bouillon LEB directement sur les géloses sélectives. De façon optionnelle, le bouillon LEB de 48 heures peut aussi être ensemencé sur les géloses sélectives au même moment où le transfert du LEB au MFB est effectué.

CONSEIL PRATIQUE : Après 20 à 24 heures d'incubation, mélanger le MFB au vortex et incuber encore 2 à 6 heures avant d'interpréter la réaction. L'interprétation après 26 heures peut réduire considérablement le nombre d'ensemencement à réaliser après 48 heures.

6.5.2

Si le bouillon MFB est positif, l'étaler en stries sur des géloses sélectives (étape 6.6). Un bouillon positif prend une couleur foncée et peut être noir, brun foncé ou vert foncé. Un bouillon négatif conserve la couleur paille du bouillon fraîchement préparé. Si le bouillon est négatif, l'incuber pendant encore 24 heures puis, s'il devient positif, l'étaler en stries sur des géloses sélectives (étape 6.6).

6.6 Méthode d'isolement

6.6.1

Mélanger le bouillon MFB au vortex, étaler le bouillon MFB positif en stries sur deux géloses distinctes. Utiliser une gélose Oxford et l'une des géloses suivantes tel que défini au point 5 : gélose ALOA, gélose A.L, gélose BBL CHROMagar Listeria, gélose au chlorure de lithium, phényléthanol et moxalactame, gélose Oxford modifiée, gélose PALCAM ou gélose RAPID'L.Mono. Incuber les géloses LPM à 30°C et toutes les géloses sélectives à 35°C pendant 48 heures à moins que la duré et la température d'incubation requises par le fabricant soient différentes. Examiner toutes les géloses à 24 heures pour des détecter la présence de colonies typiques et à 48h si applicable au milieu utilisé.

Prendre note que jusqu'à 2 géloses de chacune des géloses sélectives peuvent être ensemencées au cours d'une même analyse : une ensemencée à partir du LEB après une incubation de 24 heures, et potentiellement une deuxième ensemencée à partir d'un bouillon MFB positif.

6.6.2

Géloses OXA- Après 24 heures, Listeria spp forme des colonies noires de 1 mm de diamètre entourées d'un halo noir. Après 48 heures, des colonies noires de 2 à 3 mm de diamètre au centre affaissé et entourées d'un halo noir sont observées. Les colonies peuvent aussi présenter une apparence brun noir ou vert noir. Si les géloses sont examinées moins de 24 heures après le début de l'incubation, des colonies de Listeria sans la coloration noire caractéristique peuvent être décelées. Certaines souches de Listeria autres que L. monocytogenes sont inhibées par ce milieu s'il est incubé à 35°C.

6.6.3

Gélose Listeria selon Otaviani & Agosti - Les colonies de Listeria spp sont bleu-vert et les colonies de L. monocytogenes et L. ivanovii forment des colonies bleu-vert entourées d'un halo blanc opaque après 24 heures d'incubation. Les autres espèces Listeria forment des colonies bleu-vert sans halo. Consulter les instructions du fabricant pour une description plus détaillée.

6.6.4

Gélose A.L. - Toutes les espèces de Listeria forment des colonies bleues à bleu-vert. Les colonies de L. monocytogenes et de L. ivanovii ont des halos opaques autour des colonies après 24 et 48 heures d'incubation respectivement.

6.6.5

BBL CHROMagar - L. monocytogenes et L. ivanovii forment des colonies bleu-vert entourées d'un halo blanc opaque. Les autres espèces de Listeria forment des colonies bleu-vert sans halo.

6.6.6

Gélose LPM - Pour repérer les colonies suspectes sur les géloses LPM, examiner les géloses à l'aide d'un faisceau de lumière blanche suffisamment puissant pour bien éclairer la gélose, en formant un angle de 45E avec le fond de la gélose. Sous une transillumination optimale, les colonies de Listeria les plus isolées et les plus grosses (âgées de 48 heures) apparaissent comme des amas blanchâtres de verre pilé présentant souvent des structures internes en mosaïque et, parfois, des reflets irisés bleu gris qui ont tendance à scintiller. Les colonies peuvent aussi paraître lisses et bordées de bleu. Lorsque la croissance est confluente, un reflet bleu gris irisé et homogène peut être observé.

6.6.7

Géloses MOX- Après 24 heures, Listeria spp forme des colonies noires de 1 mm de diamètre entourées d'un halo noir. Après 48 heures, des colonies noires de 2 à 3 mm de diamètre au centre affaissé et entourées d'un halo noir sont observées. Les colonies peuvent aussi présenter une apparence brun-noir ou vert-noir. Si les géloses sont examinées moins de 24 heures après le début de l'incubation, des colonies de Listeria sans la coloration noire caractéristique peuvent être décelées. Certaines souches de Listeria autres que L. monocytogenes sont inhibées par ce milieu s'il est incubé à 35°C.

6.6.8

Gélose Brillance Listeria (autrefois gélose OCLA) - L. monocytogenes et L. ivanovii forment des colonies bleues entourées d'un halo opaque, alors que les autres espèces de Listeria forment des colonies bleuessans halo après 24 heures.

6.6.9

Gélose PAL- Les colonies de Listeria spp mesurent environ 2 mm de diamètre, ont une coloration gris-vert, un centre noir affaissé et un halo noir sur fond rouge cerise. Certaines souches d'Enterococcus et de Staphylococcus forment des colonies grises entourées d'un halo brun-vert, ou des colonies jaunes entourées d'un halo jaune

6.6.10

RAPID L. Mono - L. monocytogenes forme des colonies bleues sans halo jaune alors que L.ivanovii forme des colonies bleu-verdâtre avec un halo jaune. Les autres espèces de Listeria sont d'une couleur jaune à blanche.

6.7 Méthode d'identification - Confirmation

6.7.1 Si les colonies sont bien isolées sur les géloses sélectives

Si les colonies sont bien isolées sur les géloses sélectives : Prélever au moins cinq colonies caractéristiques de chaque gélose sélective pour les déposer sur une gélose au sang (6.7.2) et ce, pour chaque étape où des géloses sélectives ont été ensemencées (par exemple, après une incubation de 24 heures du LEB, après le noircissement du bouillon MFB, etc.)

Si les colonies ne sont PAS bien isolées sur les géloses sélectives : Prélever au moins cinq colonies caractéristiques de chaque gélose sélective pour les déposer sur une gélose au tryptose ou une gélose trypticase-soja avec de l'extrait de levure à 0,6 % en formant des stries de façon à obtenir des colonies isolées. Comme mentionné précédemment, prélever des colonies typiques pour chacune des étapes de la méthode où des géloses sélectives ont été ensemencées. Incuber les géloses à 30°C pendant 24 à 48 heures ou jusqu'à ce que la croissance soit satisfaisante. Examiner les géloses sous l'éclairage déjà décrit en 6.6.6 pour déceler les colonies caractéristiques.

Il est possible de confirmer la présence de Listeria en utilisant les épreuves de motilité, d'hémolyse et des 3 géloses de glucides (mannitol, rhamnose et xylose) ou d'autres étapes de confirmation publiées dans le Compendium des méthodes analytiques et considérées équivalentes. Des épreuves biochimiques supplémentaires sont facultatives. Des trousses d'identification rapide peuvent aider à renforcer la confirmation de ces résultats et à distinguer les différentes espèces de Listeria (6.8.1).

6.7.2 Hémolyse :

Quadriller le fond de boîtes de gélose au sang (mouton ou cheval) de façon à obtenir de 20 à 25 carrés. Prélever des colonies caractéristiques des géloses sélectives (si les colonies sont bien isolées) ou des géloses TA ou TSA-YE (si elles sont ensemencées de façon à assurer leur pureté) et ensemencer les géloses au sang par piqûre à raison d'une colonie par carré.

Toujours, ensemencer par piqûre des contrôles positifs et négatifs (L. monocytogenes, L. ivanovii and L. innocua or L. grayi) sur chaque gélose au sang.  Incuber à 35°C pendant 24 heures.

Examiner par transillumination avec un éclairage intense les géloses au sang ensemencées par piqûre (tenir la gélose de façon à ce que la lumière provienne de l'arrière de la gélose). L. monocytogenes produit une zone d'hémolyse légère au point de piqûre. L. innocua ne produit aucune zone d'hémolyse tandis que L. ivanovii produit une zone franche d'hémolyse.

6.7.3 Motilité :

Gélose : Ensemencer le milieu pour l'épreuve de motilité à partir d'une gélose sélective, TA ou TSA-YE. Incuber pour un minimum de 48 heures à la température de la pièce. Observer tous les jours. Si les résultats sont ambigus après 48 heures, l'incubation peut être  poursuivie jusqu'à 7 jours. Seules les cellules de Listeria produisent une croissance typique en forme de parapluie.

et/ou

Montage humide : Prélever au moins une colonie caractéristique sur une gélose sélective, TA ou TSA-YE incubée 30 heures ou moins, et faire un montage humide en utilisant comme milieu de suspension de la saline 0.85% et un microscope a contraste de phase muni d'un objectif a immersion.

Alternativement : Inoculer les bouillons TSB ou TSB-YE et incuber à 30°C jusqu'au lendemain. Transférer une pleine anse des cultures dans un bouillon TSB ou TSB-YE frais et incuber à 25°C pendant 6 heures. Déposer une goutte de chaque culture de 6 heures sur une lamelle de verre et examiner la motilité typique de Listeria au moyen d'un microscope à contraste de phase muni d'un objectif à immersion. Listeria spp a l'apparence d'un bâtonnet fin et court qui bouge par culbutage. Il faut toujours comparer les observations à celle d'une culture de Listeria connue. Les cocci, les gros bâtonnets et les bâtonnets qui se déplacent rapidement par des mouvements natatoires ne sont pas des Listeria spp.

6.7.4 Utilisation des glucides

Géloses Quadriller le fond des boîtes de gélose aux glucides (mannitol, rhamnose et xylose) de façon à obtenir de 20 à 25 carrés. Prélever des colonies caractéristiques des géloses sélectives, TA ou TSA-YE et ensemencer les géloses par piqûre à raison d'une colonie par carré. Chaque colonie doit être placée à la même position sur les géloses quadrillées. Des témoins positifs et négatifs (L. ivanovii, L. monocytogenes et L. grayi) doivent toujours être préparés. Incuber à 35°C pendant 24 heures.

et/ou

Bouillons Utiliser la culture sur TSB-YE pour ensemencer des bouillons pourpres additionnés de solutions 0.5% de dextrose, d'esculine, de maltose, de mannitol, de rhamnose, de "-méthyl-D-mannoside et de xylose. Incuber à 35°C pendant 7 jours. Examiner les milieux tous les jours. Listeria acidifie le milieu sans dégager de gaz ou ne produit aucune réaction.

Pour connaître les caractéristiques de fermentation des glucides des diverses espèces de Listeria, consulter le Tableau 1.

6.8 Méthode d'identification - Épreuves facultatives

6.8.1 PCR

À partir d'une colonie unique prélevée d'une gélose sélective, suivre une méthode de confirmation validée pour l'identification de l'espèce Listeria. Il est suggéré que les colonies identifiées par PCR soit aussi ensemencées sur une gélose TA ou TSA-YE a partir de la gélose au sang (6.7.2) afin d'obtenir des colonies isolées. Des épreuves biochimiques peuvent être nécessaires si mentionnées dans la méthode PCR.  Suivre les étapes décrites dans la méthode PCR et consulter cette dernière pour l'interprétation des résultats obtenus par PCR.

6.8.2 Trousses d'identification rapide

Des trousses d'identification rapide comme les épreuves Vitek ou API Listeria, Micro-ID Listeria, Listeria AccuprobeMD ou l'équivalent peuvent être utilisées. Suivre les consignes du fabricant.

6.8.3 Catalase

Soumettre une colonie caractéristique à une épreuve de dépistage de la catalase. Transférer une colonie sur une lame de verre propre et ajouter une goutte de peroxyde d'hydrogène à 3 %. La formation de bulles indique une réaction positive. Les cellules de Listeria sont catalase-positive. Éviter d'utiliser des colonies isolées de gélose contenant du sang car elles peuvent produire un résultat faussement positif.

6.8.4 Coloration de Gram

Listeria est un petit bâtonnet Gram-positif.

6.8.5 Épreuve de CAMP

Sur une gélose au sang de mouton, étaler en stries verticales des isolats frais de Staphylococcus aureus et Rhodococcus equi ß-hémolytiques. Espacer les stries verticales de manière à pouvoir étaler les souches à tester en stries horizontales, entre les stries verticales mais sans leur toucher. Après 24 à 48 heures d'incubation à 35°C, rechercher la présence d'hémolyse dans la zone des stries verticales.

6.8.5.1

L'hémolyse de L. monocytogenes et de L. seeligeri est plus prononcée à proximité de la strie de Staphylococcus et celle de L. ivanovii est plus prononcée à proximité de la strie de Rhodococcus. Les autres espèces de Listeria donnent des résultats négatifs lors de l'épreuve de CAMP. L'épreuve permet de distinguer L. ivanovii de L. seeligeri et L. seeligeri faiblement hémolytique de L. welshimeri.

6.8.5.2

L'épreuve de CAMP peut également être réalisée au moyen de disques stériles renfermant le facteur ß-lysine de S.aureus vendus dans le commerce. Pour effectuer cette épreuve, déposer un disque de ß-lysine au centre d'une gélose au sang de mouton et ensemencer la gélose avec 4 ou 5 colonies de Listeria en stries radiales sans toucher le disque avec l'inoculum. Après 18 à 24 heures d'incubation à 35°C, une réaction très nette peut être observée entre le disque et les cultures de L. monocytogenes ou de L. seeligeri. L. ivanovii est fortement hémolytique et produit une zone claire de ß-hémolyse tout le long de la strie.

6.8.6 Sérologie

Suivre les consignes du fabricant jointes aux antisérums.

6.9 Interprétation des résultats - Identification de l'espèce

Listeria spp se présente sous la forme de petits bâtonnets mobiles Gram-positif. Toutes les espèces sont catalase-positive, uréase-négative et acidifient la pente et le culot du milieu TSI sans dégager de H2S. Listeria spp fermente le dextrose, l'esculine et le maltose et certaines espèces fermentent également le mannitol, le rhamnose et le xylose et acidifient ainsi les milieux. Listeria spp montre aussi une réaction +/+ dans le bouillon RM-VP. L. grayi et L. murrayi sont les deux seules espèces à fermenter le mannitol alors que L. murrayi est la seule espèce à réduire les NO3- en NO2-. Noter qu'il a été proposé de considérer  L. grayi et L. murrayi comme une seule espèce (8.10).

L. monocytogenes et L. ivanovii  hémolysent les géloses au sang de cheval et de mouton alors que L. seeligeri est faiblement hémolytique. Les trois espèces donnent une réaction positive à l'épreuve de CAMP.  L. monocytogenes est la seule des trois espèces qui ne fermente pas le xylose mais qui est rhamnose-positive. L'épreuve de CAMP permet de distinguer L. ivanovii de L. seeligeri, puisque L. seeligeri produit une zone d'hémolyse prononcée uniquement à proximité de la strie de Staphylococcus alors que L. ivanovii produit une zone d'hémolyse prononcée à proximité de la strie de Rhodococcus.

L. innocua se différencie de L. monocytogenes uniquement par son incapacité à hémolyser la gélose au sang et par un résultat négatif à l'épreuve de CAMP. Si l'épreuve de CAMP n'est pas effectuée, il est possible de confondre L. welshimeri, qui est rhamnose-négatif, et L. seeligeri, qui est faiblement hémolytique.

Un sommaire des caractéristiques biochimiques et sérologiques, ainsi que de la pathogénicité des différentes espèces de Listeria est présenté dans les tableaux ci-joints.

7. Déclaration des résultats

7.1 Déclaration des résultats

Le rapport d'analyse final  doit contenir l'information concernant la présence ou l'absence de Listeria monocytogenes dans la portion de l'échantillon analysé. Si d'autres espèces de Listeria sont isolées, cette information peut être ajoutée dans le rapport d'analyse si toutes les parties concernées s'entendent à ce sujet.

Le rapport d'analyse final devrait aussi inclure toutes les informations nécessaires pour permettre de retracer les conditions d'analyse tels que l'identification de l'échantillon, la méthode utilisée ainsi que toutes déviations à la méthode ayant été effectuées et le poids en grammes ou le volume en millilitres de l'échantillon analysé. Toutes les informations pouvant avoir une influence sur les résultats analytiques doivent être incluses dans le rapport d'analyse.

8. Références

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• 8.2 Santé Canada, Direction générale des Produits de Santé et des Aliments 2010. La Politique sur la présence de Listeria monocytogenes dans les aliments prêts-à-manger.
• 8.3 Hitchins, A.D. 1995. Listeria monocytogenes. Chapitre 10. Révisé 1998. Bacteriological Analytical Manual (BAM). AOAC International. Gaithersburg, MD.
• 8.4 Lovett, J. 1987. Listeria isolation. Chapitre 29. Bacteriological Analytical Manual (BAM). AOAC. Arlington, Virginie.
• 8.5 Lovett, J. et A.D. Hitchins. 1988. Listeria isolation. Chapitre 29. Révisé le 13 octobre 1988. Bacteriological Analytical Manual (BAM). AOAC. Arlington, Virginie.
• 8.6 McClain, D. et W.H. Lee. 1988. Development of USDA-FSIS Method for Isolation of Listeria monocytogenes from Raw Meat and Poultry. JAOAC. 71(3):660-664.
• 8.7 McClain, D. et W.H. Lee. 1989. FSIS Method for the Isolation and Identification of Listeria monocytogenes from Processed Meat and Poultry Products. USDA-FSIS Laboratory Communication No. 57. Révisé le 24 mai 1989.
• 8.8 McLauchlin J. 2005. Listeria. In S.P. Borriello, P.R. Murray and G. Funke (ed.), Topley and Wilson's Microbiology and Microbial Infections, 10^th Edition. ASM Press, pp. 956-969.
• 8.9 Rocourt J. and C. Buchrieser. 2007. The genus Listeria and Listeria monocytogenes: Phylogenetic position, taxonomy and identification. In E.T. Ryser and E.H. Marth (ed.), Listeria, Listeriosis and Food Safety, 3^rd edition. CRC Press, pp. 1-20.
• 8.10 Rocourt J., P. Boerlin, F. Grimont, Ch. Jacquelet, and J.-C. Piffaretti. 1992. Assignment of Listeria grayi and Listeria murrayi to a single species, Listeria grayi, with a reised description of Listeria grayi. Int. J. Syst. Bacteriol. 42: 69-73
• 8.11 Seeliger, H.P.R. et D. Jones. 1986. The Genus Listeria. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Volume 2. Williams and Wilkins, Baltimore. pp. 1235-1245.
• 8.12 Wagner M. and J. McLauchlin. 2008. Biology. In D. Liu (ed.), Handbook of Listeria monocytogenes. CRC Press, pp. 3-25.
• 8.13 Warburton, D.W., J.M. Farber, A. Armstrong, R. Caldeira, T. Hunt, S. Messier, R. Plante, N.P. Tiwari et J. Vinet. 1991. A Comparative Study of the "FDA" and "USDA" Methods for the Detection of Listeria monocytogenes in Foods. Int. J. Food Microbiol.13(2):105-118.
• 8.14 Warburton, D.W., J.M. Farber, A. Armstrong, R. Caldeira, N.P. Tiwari, T. Babiuk, P. LaCasse et S. Read. 1991. A Canadian Comparative Study of Modified Versions of the "FDA" and "USDA" Methods for the Detection of Listeria monocytogenes. J. Food Prot. 54(9):669-676.
• 8.15 Warburton, D.W., J.M. Farber, C. Powell, N.P. Tiwari, S. Read, R. Plante, T. Babiuk, P. Laffey, T. Kauri, P. Mayers, M.-J. Champagne, T. Hunt, P. LaCasse, K. Viet, R. Smando et F. Coates. 1992. Comparison of Methods for Optimum Detection of Stressed and Low Levels of Listeria monocytogenes. J. Food Microbiol.9:127-145.

Tableau 1 : Caractéristiques distinctives des espèces du genre Listeria^a

Caractéristiques	L. monocytogenes	L. innocua	L. ivanovii subsp. Ivanovii	L.ivanovii subsp. Londoniensis	L. welshimeri	L. seeligeri	L. grayi
Coloration de Gram	+	+	+	+	+	+	+
Β-hémolyse	+	-	++b	++	-	+	-
Production d'acide à partir du
Mannitol	-	-	-	-	-	-	+
L-rhamnose	+	V	-	-	V	-	V
D-Xylose	-	-	+	+	+	+	-
Epreuve du CAMP
S. aureus	+	-	-	-	-	+	-
R. equi	V	-	+	+	-	-	-
Production d'acide à partir du
α-méthyl-d-mannoside	+	+	-	-	+	-	+
Amidon soluble	-	-	-	-	ND	ND	+
Ribose	-	-	+	-	-	-	V
N-acetyl-β-D-mannosamine	ND	ND	V	+	ND	ND	ND
Hydrolyse de l'hippurate	+	+	+	+	ND	ND	-
Production de lipase	+	-	+	+	-	+	-
Activite de l'Arylesterase	-	+	+	+	+	+	+
Reduction des nitrates	-	-	-	-	ND	ND	V

^a + ≥ 90 % des souches sont positives; - ≥ 90 % des souches sont negatives; ND non determiné : V, variable. Adaptées de 8.1, 8.8, 8.9, 8.11 et 8.12.

^b++, habituellement une zone d'hémolyse plus large est observée.

Tableau 2 : Sérotype, activité hémolytique et virulence pour la souris de différentes espèces de Listeria

Espèce	Sérotype	Hémolyse de piqûre au sang de cheval (7 %)	Virulence pour la souris
L. monocytogenes	1/2a, 1/2b, 1/2c, 3a, 3b, 3c, 4a, 4ab, 4b, 4b(x), 4c, 4d, 4e, 7	+	+
L. ivanovii	5	+	+
L. innocua	4ab, 6a, 6b, in*	-	-
L. welshimeri	6a, 6b	-	-
L. seeligeri	1/2b, 4c, 4d, 6b, in*	+	-

* in; indéterminé

Figure 1 Schéma de la méthode d'isolement

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