MFLP-12: Identification de Escherichia coli O157:H7 et Escherichia coli O157:NM produisant de la vérotoxine au moyen du technologie PCR en temps réel du système de détection rapide de pathogènes ADIAFOOD

Procédure de laboratoire MFLP-12
Mars 2009

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Identification de escherichia coli O157:H7 et escherichia coli O157:NM produisant de la vérotoxine au moyen de la technologie pcr en temps réel du système de détection rapide de pathogènes ADIAFOOD

Microbiologiste, Agence canadienne d'inspection des aliments
1400, chemin Merivale,
Ottawa ON K1A 0Y9

Courriel : stephen.shaw@inspection.gc.ca

1. Application

Cette méthode s'applique à l'identification rapide des souches de Escherichia coli O157:H7 (E. coli O157:H7) et des souches de Escherichia coli O157:NM (E. coli O157:NM) producteur de la vérotoxine isolées dans le boeuf haché cru au moyen de la technique classique de culture de E. coli O157:H7, MFLP-80 (8.1), d'autres méthodes de la DGPSA ou de la méthode PCR en temps réel ADIAFOOD pour l'enrichissement de E. coli O157:H7 en 8 heures. Cette méthode peut être appliquée à l'identification présomptive de E. coli O157:H7/NM dans des cultures de bouillon d'enrichissement. Si des mesures de conformité fondées sur les produits sont prévues, et lorsque stipulée, la méthodologie de la DGPSA, MFLP-80 (8.1) ou l'équivalent, est utilisée pour la confirmation finale des échantillons présumés positifs obtenus par la réaction PCR en temps réel ADIAFOOD.

Cette méthode révisée remplace la méthode MFLP-12 datée de janvier 2006.

2. Principe

Après la procédure d'enrichissement du boeuf haché cru, le bouillon d'enrichissement est soumis à la réaction PCR temps réel qui amplifie et détecte l'ADN pathogène ciblé à l'aide d'amorces et de phares moléculaires spécifiques. Les phares moléculaires sont des séquences uniques permettant l'identification du pathogène à un degré de spécificité élevé. Une fois liés à leur cible, les phares moléculaires émettent un signal fluorescent, proportionnel à la quantité d'ADN pathogène amplifié. Si la bactérie ciblée est absente de l'échantillon alimentaire, aucun signal fluorescent n'est détecté.

Pour la détection de E. coli O157:H7, deux marqueurs sont utilisés. Le premier détecte la présence de E. coli O157 et le second confirme la présence de E. coli O157:H7. Les souches de E. coli O157:NM (non-motiles) qui sont productrices de vérotoxine, et qui sont ainsi pathogéniques, seront également détectées. Les souches O157:NM qui ne sont pas productrices de vérotoxine ne le seront pas. Ensemble, les résultats positifs obtenus par ces deux marqueurs confirmeront la présence de contamination par E. coli O157:H7 ou par E. coli O157:NM, producteur de vérotoxine, dans l'échantillon alimentaire.

La procédure complète, après enrichissement, permet d'identifier en 3 heures les échantillons positifs présomptifs et peut remplacer les tests de dépistage habituels fournissant ainsi une économie de temps, de main d'oeuvre et de coût d'analyse. La technique PCR en temps réel s'est révélée une méthode spécifique et sensible pour l'identification présomptive de E. coli O157:H7 et de E. coli O157:NM produisant de la vérotoxine, à partir d'échantillons de boeuf haché cru (8.2).

Le système de détection rapide de pathogènes ADIAFOOD par PCR en temps réel pour E. coli O157:H7/NM a été validé par l'AOAC-RI et a reçu le statut de « Performance Tested Method^SM » en 2004, Numéro de certificat : 010409.

ADIAFOOD* est une marque déposée d'AES Chemunex; (Rue Maryse Bastié - Ker Lann, CS 17219 - F-35172 Bruz Cedex, Phone: 33 (0)2 23 50 12 12, Fax: 33 (0)2 23 50 12 00, www.aes-lab.com). *La marque déposée est en suspens au Canada.

3. Définition des termes

Voir l'annexe A du volume 3.

4. Prélèvement des échantillons

Voir l'annexe B du volume 3.

5. Amorces spécialisées, réactifs, tampons, matériel et équipement

Note : Il est de la responsabilité du superviseur du laboratoire de voir à ce que l'analyse décrite dans cette méthode soit réalisée en accord avec la Norme Internationale intitulée « ISO/IEC 17025:2005 (ou version plus récente): Prescriptions générales concernant la compétence des laboratoires d'étalonnages et d'essais ».

5.1 Matériel et équipement

5.1.1 Composantes de la trousse ADIAFOOD

Tampon d'extraction (EX-1)
Réactif d'extraction, lyophilisé (EX-2)
Tampon de détection (DT-1)
Réactif de détection, lyophilisé (DT-2)
Microplaques de détection ou barrettes de tubes contenant les réactifs PCR pré-distribués
Barrettes de contrôle PCR (seulement avec les trousses de barrettes de détection)
Bouchons PCR de qualité optique

Note: Toutes les trousses sont produites par AES Chemunex Canada, www.aeschemunex.com et distribuées au Canada par Innovation Diagnostics, www.innovationdiagnostics.com, 1-888-965-1871.

5.1.2 Consommables additionnels et équipements requis

Thermocycler PCR en temps réel validé par AES*
Thermocycler conventionnel pour l'extraction de l'ADN (facultatif)
Centrifugeuse comprenant rotor et support de microplaque
Vortex adapté aux microplaques
Deux pipettes à multicanaux
Pipette à canal simple
Enceinte PCR (optionel)
Fermoir PCR
Supports à barrettes
Trousse d'extraction ADIAFOOD (contenant les plaques d'extraction, bouchons bombés et films scellant)
Embouts de pipettes avec filtre
Bassins jetables pour pipettes à multicanaux
Tubes stériles (2 ml) à bouchon vissable pour microcentrifugation
Gants sans poudre
Milieu(x) d'enrichissement requis
Sacs Stomacher avec filtre
Pipettes sérologiques jetables
Alcool dénaturé et eau de Javel

*Spécifications du thermocycleur PCR en temps réel : capacité d'analyser une microplaque "low" et "high profile" de 96 (48) puits ou 96 (48) tubes PCR "low" et "high profile" de 0,2 ml et la capacité d'exciter des fluorophores ayant un pic d'excitation de 485 à 520 nm et de détecter des fluorophores ayant un pic d'émission de 500 à 600 nm.

5.2 Marqueurs moléculaires, programme des cycles de température, tampons et réactifs

5.2.1 Marqueurs moléculaires

Les amorces et les phares moléculaires sont fournis dans chaque trousse de détection et leur spécificité pour E. coli O157:H7/NM a été vérifiée (8.2).

5.2.2 Programmes des cycles de température

Les programmes des cycles de température de la réaction PCR incluent un cycle automatisé d'extraction favorisant la lyse des cellules bactériennes suivi d'un programme automatisé de détection.

5.2.3 Tampons et réactifs

Tous les tampons et les réactifs sont fournis par AES Chemunex. La trousse inclut les tampons et réactifs requis pour l'extraction (EX-1, EX-2) et les tampons et réactifs de détection (DT-1, DT-2). Tous les autres réactifs de détection sont déjà pré-distribués dans les puits de la microplaque ou Barrettes de détection. L'eau, les micropipettes, les embouts de pipette et tout le matériel entrant en contact avec les échantillons ou les réactifs PCR devraient être stériles et sans ADNase et/ou autoclavés avant usage afin d'éliminer toute trace d'ADNase ou d'autres contaminants.

6. Marche à suivre

6.1 Manipulation des échantillons

Les échantillons sont préparés et enrichis selon la méthode de culture classique pour l'isolement de E. coli O157:H7 (8.1), d'autres méthodes de la DGPSA ou par la méthode ADIAFOOD pour l'enrichissement de l'échantillon en 8 heures, selon les instructions du fabricant. Prélever une portion du bouillon d'enrichissement et la soumettre à la procédure PCR, tel qu'indiqué ci-dessous. Des puits de contrôles positifs et de contrôles négatifs sont aussi soumis à l'analyse avec chaque groupe d'échantillons.

6.2 Extraction de l'ADN

6.2.1 Vider le contenu de la bouteille EX-1 (bouteille de plastique souple) dans la fiole EX-2 pour obtenir la solution EX-2 reconstituée.

6.2.2 Refermer la fiole EX-2 et agiter par inversion pour assurer la dissolution complète du réactif déshydraté.

6.2.3 Verser la solution EX-2 reconstituée dans un bassin pour pipette à multicanaux.

6.2.4 Aliquoter 90 µL de la solution EX-2 reconstituée dans chaque puits de la microplaque d'extraction (3 puits par échantillon).

6.2.5 Transférer 10 μL de la suspension cellulaire (étape 6.1) dans les puits de la microplaque d'extraction selon le schéma d'affectation prédéterminé.

6.2.6 Sceller les puits de la microplaque d'extraction avec les bandes de bouchons bombés fournies.

6.2.7 Placer la microplaque d'extraction dans le thermocycleur

6.2.8 Débuter le programme d'extraction de l'ADN du thermocycleur.

6.2.9 Lorsque le programme d'extraction est complété, retirer la microplaque d'extraction. Tous les microorganismes sont maintenant lysés et inactivés.

6.2.10 Centrifuger la microplaque d'extraction pendant 5 minutes à une vitesse de 1,800 x g. Le surnageant peut maintenant être utilisé pour la méthode de détection (amplification) par PCR.

6.3 Méthode de détection (amplification) par PCR

6.3.1 Vider le contenu de la bouteille DT-1 (bouteille de plastique souple) dans la fiole DT-2 pour obtenir la solution DT-2 reconstituée.

6.3.2 Refermer la fiole DT-2 et agiter par inversion pour assurer la dissolution complète du réactif déshydraté.

6.3.3 Verser la solution DT-2 reconstituée dans un bassin pour pipette à multicanaux.

6.3.4 Retirer une microplaque de détection ou le nombre requis de barrettes de détection de l'enveloppe.

6.3.5 Aliquoter 15 μL de la solution DT-2 reconstituée dans la microplaque de détection ou dans les barrettes.

6.3.6 Transférer 10 μL d'extrait d'ADN provenant de chaque puits de la microplaque d'extraction dans les puits de la microplaque ou des barrettes de détection.

6.3.7 Sceller la microplaque de détection ou les barrettes de détection avec les bouchons optiques pour PCR fournis.

6.3.8 Sceller la microplaque d'extraction en utilisant le film scellant fourni et l'entreposer à 4°C jusqu'à ce que l'analyse soit complétée.

6.3.9 Inverser vigoureusement la microplaque ou les barrettes, 4 fois, afin de permettre un brassage adéquat des réactifs dans les puits.

6.3.10 Tapoter la microplaque légèrement afin d'éliminer les bulles d'airs dans les puits.

6.3.11 Agiter la microplaque ou barrettes de détection à l'aide du vortex, à vitesse maximale, pendant 1 minute.

6.3.12 Centrifuger la microplaque ou les Barrettes de détection pendant 1 minute à 1800 x g afin d'assurer que les réactifs PCR ainsi que l'échantillon d'ADN se retrouvent bien au fond des puits de la microplaque PCR.

6.3.13 Bien fixer la microplaque ou les barrettes de détection dans l'appareil PCR. S'assurer que le puits A1 se retrouve dans le coin supérieur gauche et sélectionner l'icône « Start Detection » pour débuter le protocole d'analyse.

6.3.14 Lorsque le programme de détection sera complété, enlever la microplaque ou les barrettes de détection de l'appareil et les jeter.

7. Interprétation des résultats

Les amplicons (produits de la réaction PCR) générés par les séquences cibles de E. coli O157/O157:H7/NM sont des fragments d'ADN double brin. Lors d'un résultat PCR positif, la réponse mesurée par fluorescence sera plus élevée que celle du seuil de référence exprimé par les témoins négatifs en moins de 40 cycles d'amplification de la réaction PCR. La valeur seuil de référence de la fluorescence est déterminée et établie par le système. Un résultat négatif n'émettra normalement pas de fluorescence. S'il y a émission de fluorescence au-dessus de la valeur du seuil de référence dans les témoins négatifs, les résultats du test ne sont pas valides et l'analyse doit être reprise après avoir pris soin d'éliminer toutes les sources d'erreur possibles. Tout échantillon trouvé positif au moyen de la technique PCR en temps réel ADIAFOOD doit être confirmé avec les épreuves biochimiques requises décrites dans la méthode de la DGPSA MFLP-80 (8.1) ou méthodes équivalentes.

8. Références

8.1 Warburton, D. et D. Christensen, 2006. MFLP-80. Isolement de E. coli O157:H7 ou NM dans les aliments. Dans: Volume 3, Compendium de méthodes. Publié sur le site web de Santé Canada à: http://www.hc-sc.gc.ca/fn-an/res-rech/analy-meth/microbio/volume3/index-fra.php.

8.2 Warnex Recherche Inc. 2005. Validation du système rapide de détection de pathogènes WarnexMC pour E. coli O157:H7/NM, enrichissement en 8 heures dans le boeuf haché cru (données internes non publiées et données de l'AOAC).