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Divulgation proactive

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Aliments et nutrition

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La méthode lateral flow system^mc 48 heures de Dupont^mc pour la détection de salmonella spp. dans les viandes crues et transformées

Procédure de laboratoire MFLP-18
Novembre 2007

Si vous avez besoin d'aide pour accéder aux formats de rechange, tels que Portable Document Format (PDF), Microsoft Word et PowerPoint (PPT), visitez la section d'aide sur les formats de rechange.

(Version PDF - 33 ko)

DIRECTION GÉNÉRALE DES PRODUITS DE SANTÉ ET DES ALIMENTS

OTTAWA

Comité des méthodes microbiologiques
Division de l'évaluation
Bureau des dangers microbiens, Direction des aliments
Direction générale des produits de santé et des aliments, Santé Canada
Repère postal : 2204A1
Ottawa (Ontario) K1A 0L2

Courriel : Don_Warburton@hc-sc.gc.ca

1. Application

Cette méthode s'applique à la détection de Salmonella spp. dans les viandes crues (poulet, dindon, boeuf et porc hachés ainsi que les eaux de lavage des carcasses de poulet) ainsi que dans les viandes transformées (charcuterie de dindon uniquement).

Note: Bien que cette méthode soit approuvée uniquement pour certains produits alimentaires, tel qu' indiqué ci-dessus, on suppose qu'elle peut être utilisée pour d'autres produits alimentaires. Dans ce cas, il est impératif que le superviseur du laboratoire s'assure d'effectuer une validation à un niveau approprié, de l'application de cette méthode à d'autres produits alimentaires afin de respecter les exigences d'accréditation du CCN. On demande de transmettre ces données de validation à Don Warburton (à l'adresse ci-dessus) de sorte qu'on puisse intégrer ces nouveaux produits de base à la section « Application ».

2. Description

2.1 Les essais Lateral Flow System^mc de DuPont^mc pour Salmonella ont été conçus pour détecter Salmonella spp. dans les viandes crues et transformées. Cet essai permet la détection et l'identification présumée du pathogène cible lorsque celui-ci est présent à un niveau d'un organisme Salmonella par 25 grammes d'échantillon. L'essai fournit une procédure simplifiée produisant des résultats présumés après 24 heures (à l'aide de la méthode Lateral Flow System^mc de DuPont^mc pour Salmonella) ou 48 heures (à l'aide d'une méthode d'enrichissement standard). Les bandelettes d'essai pour Salmonella sont conçues pour être utilisées par des techniciens formés qui suivent de bonnes pratiques de laboratoire de microbiologie. Le protocole implique l'utilisation de micro-organismes potentiellement dangereux; il faut donc respecter les consignes de sécurité appropriées.

On recommande à l'analyste de lire la « Limite de garantie et de responsabilité » (dans la notice d'accompagnement du produit) avant d'utiliser ce produit.

3. Principe

3.1 Cet essai immunologique est de type "sandwich" à double anticorps. Un anticorps spécifique à Salmonella est pulvérisé et immobilisé dans une ligne d'essai sur la surface d'une membrane. Un second anticorps réactif, qui reconnaît également Salmonella, marqué à l'or colloïdal, est contenu dans le coussinet de réactifs en amont de la ligne d'essai de la membrane.

3.2 À mesure que le liquide se déplace, par diffusion capillaire, dans le coussinet de réactifs , le réactif anticorps-or se lie spécifiquement à Salmonella et se déplace avec l'échantillon jusque dans la membrane d'essai. Lors de son déplacement dans la membrane d'essai, l'échantillon traverse la ligne d'essai où l'anticorps de Salmonella immobilisé capture le complexe Salmonella-anticorps-or pour former un « sandwich » d'anticorps-Salmonella. La ligne d'essai devient alors de couleur rouge. En l'absence de Salmonella, aucun sandwich d'anticorps-Salmonella ne se forme et la ligne d'essai ne devient pas de couleur rouge.

3.3 Les réactifs immobilisés à la ligne témoin capturent l'excès de réactif or qui traverse la ligne d'essai. Ceci entraîne la coloration de la ligne témoin en rouge et indique que l'essai s'est déplacé de façon adéquate sur la bandelette.

3.4 Par conséquent, une seule ligne (témoin) sur la membrane indique un échantillon négatif et deux lignes (d'échantillon et témoin) indiquent un échantillon présumé positif.

4. DÉFINITION DES TERMES

Voir l'annexe A du volume 3.

5. PRÉLÈVEMENT DES ÉCHANTILLONS

Voir l'annexe B du volume 3.

Haut de la page

6. MATÉRIEL ET ÉQUIPEMENT SPÉCIAL

Note: Le superviseur du laboratoire doit veiller à ce que l'analyse décrite dans cette méthode soit appliquée conformément à la norme de l'Organisation internationale de normalisation intitulée « ISO/CEI 17025:2005 (ou la version la plus récente), Prescriptions générales concernant la compétence des laboratoires d'étalonnages et d'essais ».

Les milieux de culture et les réactifs indiqués ci-dessous sont disponibles commercialement; ils doivent être utilisés, préparés et(ou) stérilisés conformément aux directives du fabricant. Voir également l'annexe G du volume 3 pour connaître la formule de la plupart des milieux particuliers.

Note: Si l'analyste utilise toute variation des milieux énumérés dans le présent document (produit disponible commercialement ou préparé au laboratoire à partir d'ingrédients), il incombe à l'analyste ou au surveillant du laboratoire d'en assurer l'équivalence.

1) Trousse d'essai Lateral Flow System^mc de Dupont^mc pour Salmonella (PN 18220009 - 50 bandelettes d'essai))

2) Eau peptonée tamponée (EPT) - disponible commercialement

3) Lactose Broth (LB) - disponible commercialement

4) Base de bouillon TT (tétrathionate), Hajna - disponible commercialement

5) Balance - de 25 à 1000 grammes précise à 0,2 g près

6) Mélangeur Stomacher avec sacs à filtres (Circulateur Seward Stomacher® 400 ou l'équivalent)

7) Incubateurs capables de maintenir des températures de 35 et de 42 +/- 0,5 °C

Note: Il est de la responsabilité de chaque laboratoire de veiller à ce que les incubateurs et les bains-marie soient maintenus à la température recommandée. Lorsqu'on recommande une température de 35 °C dans le texte de la méthode, la température des incubateurs et des bains-marie peut varier de +/-1,0 °C. Il en est de même pour les températures plus basses de 30 ou 25 °C. Toutefois, dans le cas où des températures plus élevées sont recommandées, comme 43 ou 45,5 °C, l'écart ne doit absolument pas dépasser 0,5 °C, puisque l'excès de température pourrait détruire le micro-organisme que l'on cherche à isoler.

8) Tubes à essais (15 ml) avec support

9) Tubes en plastique (12 x 75 mm) avec support

10) Pipettes (400 μL) pour les transferts

11) Témoins positif et négatif (utiliser des cultures ATCC ou l'équivalent)

7. MANIPULATION DES UNITÉS D'ÉCHANTILLONNAGE

7.1 Analyser les échantillons le plus tôt possible. Au besoin, conserver les échantillons pendant une période et à une température qui empêcheront la croissance ou la destruction de la microflore endogène. Si des unités d'échantillonnage ont été altérées en transit, il faut échantillonner à nouveau le lot.

7.2 Faire dégeler les échantillons congelés en 60 minutes à la température ambiante; si ce n'est pas possible, laisser décongeler les échantillons au réfrigérateur (entre 4 et 10 °C).

7.3 Si le poids de l'unité d'échantillonnage reçue pour analyse est inférieur au poids recommandé, analyser la quantité disponible et consigner le poids exact utilisé.

7.4 Lors de l'homogénéisation des échantillons, limiter le temps de traitement au minimum nécessaire pour obtenir une suspension homogène. Un temps de traitement excessif peut causer des dommages physiques qui peuvent nuire à la viabilité de la microflore endogène.

7.5 Utiliser des techniques aseptiques et du matériel stérile à toutes les étapes de l'analyse. La sécurité pendant la manipulation des produits sous forme de poudre est primordiale si l'on veut éviter la contamination croisée du milieu de travail.

8. PRÉPARATION ET ENRICHISSEMENT DES ÉCHANTILLONS

8.1 Groupement des unités d'analyse

8.1.1 Afin de réduire la charge de travail, on peut réunir jusqu'à 15 unités de 25 g (mL) en un seul échantillon d'analyse (p. ex. de 375 g ou mL). Lors du groupement, il faut maintenir un ratio d'échantillonnage de 1:10 avec le bouillon d'enrichissement primaire.

8.1.2 Si une unité d'échantillonnage comporte plus d'un contenant, mélanger le contenu des contenants dans des conditions d'asepsie avant de prélever l'unité d'analyse. Si ce n'est pas possible ou pratique, l'unité d'analyse doit alors être constituée de portions égales de chaque contenant.

8.2 Enrichissement primaire

8.2.1 Verser 25 grammes d'échantillon dans un sac Stomacher stérile.

8.2.2 Ajouter 225 mL d'eau peptonée tamponnée (ou du bouillon au lactose pour les viandes transformées telles les charcuteries de dindes) dans le sac.

8.2.3 Mélanger les échantillons pendant 1 à 2 minutes.

8.2.4 Préparer un témoin positif à l'égard de Salmonella et ainsi qu'un témoin de milieu négatif en parallèle avec les échantillons à analyser.

8.2.5 Incuber le milieu de pré-enrichissement et les témoins positif et négatif à 35 °C pendant 22 à 25 heures.

8.2.6 Sortir le sac de l'incubateur et en mélanger délicatement le contenu en faisant tournoyer doucement le sac.

Note: Il ne devrait y avoir aucun signe de croissance après l'incubation du témoin négatif; s'il y a absence de croissance dans le témoin positif, les résultats de l'épreuve ne sont pas valables.

8.3 Enrichissement secondaire

8.3.1 Transférer 1.0 mL du bouillon d'enrichissement EPT dans 10 mL de bouillon TT (Hajna). Incuber pendant 22 à 26 heures à 42 °C.

8.4 Mise à l'essai des échantillons

8.4.1 Identifier les tubes de chaque échantillon et les disposer dans un support.

8.4.2 Transférer 400 μl d'échantillon enrichi dans un tube.

8.4.3 Retirer le nombre requis de bandelettes de leur contenant. Ne pas enlever l'étiquette des bandelettes.

8.4.4 Insérer la bandelette dans le tube, les flèches pointées vers le bas.

8.4.5 Laisser réagir la bandelette pendant 10 minutes, puis vérifier les résultats, comme suit :

8.4.6 Au moins une ligne, en l'occurence la ligne témoin, doit toujours se former. Une ligne rouge indique que la bandelette fonctionne adéquatement.

8.4.7 Si, au bout de 10 minutes, la bandelette d'essai n'affiche qu'une seule ligne témoin visible, c'est signe que l'échantillon est négatif (absence de Salmonella).

8.4.8 Une ligne rouge apparaissant sous la ligne témoin est celle de l'essai et elle indique un résultat positif. Lorsque la bandelette d'essai affiche deux (2) lignes rouges, l'essai est terminé et l'échantillon est positif (présence de Salmonella).

8.4.9 Si aucune ligne témoin ne se forme dans un délai de 10 minutes, l'essai est invalide et il doit être répété.

Note: Il faut toujours interpréter les résultats après 10 minutes. Les bandelettes d'essai interprétées après 20 minutes ne sont plus valides.

8.5 Confirmation des résultats présumés positifs

8.5.1 Il faut confirmer par culture, à l'aide de l'enrichissement secondaire, les résultats positifs par LFS, tel qu'il est décrit dans la méthode MFHPB-20

9. RÉFÉRENCES

D'Aoust J.-Y. et Purvis U. 1998. MFHPB-20. Isolement et identification des Salmonella dans les aliments. Compendium des méthodes analytique, volume 2. Direction générale de la protection de la santé, Ottawa, Canada. (http://www.hc-sc.gc.ca/food-aliment/mh-dm/mhe-dme/compendium/f_index.html)