La méthode du système Qualicon BAX ® pour la détection de Listeria monocytogenes dans une variété d'aliments

Procédure de laboratoire MFLP-28
octobre 2011

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Comité des méthodes
Division de l'évaluation microbiologique
Bureau des dangers microbiens, Direction des Aliments
Direction générale des produits de Santé et des Aliments, Santé Canada
Repère postal : 2204E
Ottawa ON K1A 0K9

Courriel : micro_methods_committee @hc-sc.gc.ca

1. Application

Cette méthode est applicable à la détection de Listeria monocytogenes afin de déterminer s'il y a conformité avec les articles 4 et 7 de la Loi sur les aliments et drogues. Les résultats positifs doivent être confirmer à l'aide d'une méthode de culture. Cette méthode à été validée pour l'utiilisation dans tous les aliments et les échantillons environnementaux. Cette méthode revisée remplace la méthode MFLP-28 datée de février 2011.

2. Description

Le système BAX® est un instrument pratique de dépistage oui/non qui utilise la technologie de la réaction en chaîne de la polymérase (PCR) pour l'amplification rapide et la détection par fluorescence. Les transformateurs de produits alimentaires et les laboratoires associés peuvent se servir du système BAX® comme méthode rapide permettant de détecter avec précision les Listeria monocytogenes dans une grande variété d'aliments. Après la période d'enrichissement primaire de 24 à 48 heures et d'enrichissement secondaire de 18 à 24 heures, la préparation de l'échantillon requiert environ une heure du temps de l'utilisateur, et la procédure automatisées donne des résultats fiables dans un délai d'environ 4 heures. Les études portant sur la validation du système BAX® utilisaient la méthode d'enrichissement du USDA-FSIS pour la viande, la volaille et les œufs; la méthode 993.12 de l'AOAC pour les produits laitiers; et la méthode FDA-BAM pour les autres types d'aliments (voir la section 8 : Méthodes de référence). Le système BAX® est conçu pour être utilisé par un personnel de laboratoire qualifié qui suit les procédures normalisées de microbiologie.

3. Principe

Le système BAX® utilise la réaction en chaîne de la polymérase (PCR) pour amplifier un fragment précis de l'ADN bactérien qui est stable et non affecté par l'environnement de croissance. Le fragment est une séquence génétique unique à Listeria monocytogenes. C'est pourquoi la méthode constitue un indicateur très fiable de la présence de Listeria monocytogenes. Le système BAX® automatisé utilise ensuite la détection par fluorescence pour analyser le produit de la PCR et déterminer si les résultats sont positifs ou négatifs.
Le PCR représente un moyen puissant d'offrir rapidement des millions de copies d'un fragment précis d'ADN. Dans une application typique, on combine l'échantillon d'ADN à une polymérase, des nucléotides et des amorces spécifiques à une séquence donnée de nucléotides. Ce mélange est alors soumis à une série de cycles chronométrés de chauffage et de refroidissement. Le chauffage dénature ou sépare l'ADN en brins distincts. À mesure que le mélange refroidit, les amorces reconnaissent la séquence cible d'ADN et s'y fixent par annelage. L'ADN polymérase utilise ensuite les nucléotides pour étendre les amorces, ce qui a pour effet de créer deux copies du fragment d'ADN cible. Des cycles répétés de dénaturation, d'hybridation et d'élongation produisent des augmentations exponentielles du nombre de fragments d'ADN cibles en quelques heures à peine. Si la séquence cible n'est pas présente, il ne se produit aucune amplification détectable.

Le système BAX® simplifie ce processus en combinant les amorces, la polymérase, les nucléotides et le témoin positif dans une seule tablette d'échantillon déjà emballée dans des tubes PCR. De plus, la détection automatique par fluorescence permet les tests en tubes fermés, éliminant la possibilité de contamination entraînée avec l'ADN amplifié.

4. Definition des termes

Voir l'annexe A du volume 3.

5. Prelevement des echantillons

Voir l'annexe B du volume 3.

6. Matériel et équipements spéciaux

Note : Il est de la responsabilité du superviseur du laboratoire de voir à ce que l'analyse décrite dans cette méthode soit réalisée en accord avec la Norme Internationale intitulée « ISO/IEC 17025:2005 (ou la version plus récente): Prescriptions générales concernant la compétence des laboratoires d'étalonnages et d'essais».

Note : Il incombe à chaque laboratoire de s'assurer que les incubateurs ou les bains-marie sont maintenus à la température recommandée. Lorsqu'on recommande 35 °C dans le texte de la méthode, l'incubateur peut être réglé à 35 ± 1,0 °C. De même, les températures plus basses de 30 ou 25 °C peuvent être réglées à ± 1,0 °C près. Toutefois, lorsqu'on recommande des températures plus élevées, comme 43 ou 45,5 °C, il est impératif de maintenir les incubateurs ou les bains-marie à ± 0,5 °C parce que des températures plus élevées peuvent être létales pour le micro-organisme qu'on cherche à isoler.

6.1 Fournis avec la trousse - (n° 17710609; permettent d'effectuer 96 tests; DuPont Qualicon, téléphone : 1 (800) 863-6842, télécopieur : (302) 695-5301)

2 sachets Tablettes d'échantillon PCR, emballées 1 tablette par tube PRC dans 12 bandelettes de 8 tubes. Les tablettes comprennent les réactifs nécessaires à la réaction du test ainsi qu'un témoin positif interne (ce qui évite d'avoir à exécuter une réaction CQ distincte). Les tablettes pèsent 7,6 ± 0,1 mg.

1 sachet Bouchons optiques, 12 bandelettes de 8 bouchons.

2 bouteilles Tampon de lyse, pH de 8,35 ± 0,05 à 25 °C , 12 ml/bouteille. Utiliser pour préparer le réactif de lyse.

1 flacon Solution de protéase, 400 ul/flacon. Utiliser pour préparer le réactif de lyse.

6.2 Bouillons d'enrichissement
Enrichissement primaire - varie selon le type d'aliments (voir la section 7)
Bouillon UVM
Bouillon Demi-Fraser

6.3 Enrichissement secondaire
MOPS-BLEB

6.4 Équipements
Stomacher
Incubateur
Microcentrifuge
Vortex

6.5 Matériel fourni avec la trousse de démarrage du système BAX®
Cycleur/détecteur avec plaques de vérification
Poste de travail informatique avec le système d'exploitation Microsoft Windows, le logiciel du système BAX et une imprimante
Blocs de chauffage avec dispositif d'ancrage à thermomètres pour les tubes de lyse
Outils de capsulage/décapsulage
Blocs de refroidissement avec dispositif d'ancrage pour les tubes de lyse et les tubes PCR
Guide d'utilisation du Système BAX®

6.6 Matériel supplementaires
Tubes PCR
Eau de grade moléculaire (stérile et libre de DNase)
Tubes de lyse avec bouchons et supports
Supports pour tubes PCR
Embouts de pipette
Gants de nitrile sans poudre
Pipettes variées pour les transferts de réactifs et des échantillons

7. Procédure

7.1 Prélèvement et enrichissement des échantillons

Note : Pour ajouter de la flexibilité dans les périodes d'incubation décrites dans la méthode, les directives suivantes peuvent être appliquées: les périodes d'incubation de 24 heures sont de ± 2h et celles de 48 heures, de ± 4 h.

Pour les échantillons alimentaires : Ajouter 25 g ou ml de l'aliment (unité analytique) dans un à 225 ml de bouillon d'enrichissement (voir tableau ci-dessous) dans un contenant stérile. Pour les échantillons composites, les unités analytiques peuvent être combiné jusqu'à 125g ou ml (p. ex : 125 g ou ml dans 1125 mol de bouillon d'enrichissement). Si des unités analytiques différentes sont utilisées, maintenir un rapport d'une partie d'échantillons pour 9 parties de bouillon d'enrichissement.

Pour les échantillons alimentaires er environnementaux, mélanger, stomacher ou vortexer de façon a bien mélanger. Les bouillons d'enrichissement peuvent être incuber dans les sacs a stomacher ou dans tout autre contenant stérile.

Type d'échantillon	Enrichissement primaire Pré -chauffer a 30 °C ± 1,0 °C	Enrichissement secondaire
Viande et volaille crue	Peser 25 g de l'échantillon dans un contenant stérile. Homogénéiser avec 225 ml de bouillon Demi Fraser. Incuber à 30 °C pendant 24 heures.	Après 24 h d'incubation, bien mélanger le bouillon de pré-enrichissement et transférer 0.1 mL d'échantillon enrichi à 9,9 ml de bouillon MOPS-BLEB. Incuber à 35 °C pendant 18 à 24 heures.
Viande et volaile prete-a-manger	Peser 25 g de l'échantillon dans un contenant stérile. Homogénéiser avec 225 ml de bouillon LEB (UVM1). Incuber à 30 °C pendant 48 heures.	Après 48 h d'incubation, bien mélanger le bouillon de pré-enrichissement et transférer 0.1 mL d'échantillon enrichi à 9,9 ml de bouillon MOPS-BLEB. Incuber à 35 °C pendant 18 à 24 heures.
Fruits et legumes
Poissons et fruits de mer (incluant poisson fume)
Produits laitiers
Autres aliments
Écouvillons environnementaux	Ajouter l'éponge ou un grand écouvillon à 100 ml de LEB (UVM1) ou composite comportant jusqu'à 10 éponges/ou écouvillons avec 100 ml de LEB par éponges/ écouvillons (voir MFLP-41) Placer les plus petits écouvillons (par ex. coton-tige) dans 10ml de LEB (UVM1) ou un composite comportant jusqu'à 10 écouvillons avec 10ml de LEB (UVM1) par écouvillon Incuber à 30 °C pendant 48 heures.	Après 48 h d'incubation, bien mélanger le bouillon de pré-enrichissement et transférer 0.1 mL d'échantillon enrichi à 9,9 ml de bouillon MOPS-BLEB. Incuber à 35 °C pendant 18 à 24 heures.

Procéder a l'étape 7.2 ou continuer avec l'etape 7.1b si-dessous

7.1b Centrifugation et lavage des cellules (L'étape facultative de centrifugation s'applique uniquement aux viandes prête-à-manger)

• 7.1.1 Transférer 1 mL du bouillon MOPS-BLEB dans un microtube stérile exempt de DNase de 1.5mL et centrifuger 3 min. à 9,000 - 13,000 x g.
• 7.1.2 Enlever le surnageant et resuspendre le culot dans 1 mL d'eau exempte de DNase et RNase et vortexer pendant 10 sec.
• 7.1.3 Centrifuger 3 min. à 9,000 - 13,000 x g. Enlever le surnageant et resuspendre le culot dans 0.1 mL d'eau exempte de Dnase et Rnase pour concentrer les cellules d'un facteur 10.
• 7.1.4 Vortexer le tube a haute vitesse pour complètement resuspendre le culot et ajouter 5µL de cette suspension à un tube de lyse BAX® contenant 0.2 mL de réactif de lyse (étape 7.3.1.4.). Continuer l'analyse à partir de cette étape.

7.2 Préparation de l'équipement (consulter le guide d'utilisation du Syst me BAX® pour de plus amples détails)

• 7.2.1 S'assurer que les blocs de refroidissement ont été réfrigérés durant la nuit.
• 7.2.2 Faire chauffer les blocs de chauffage. S'assurer que les températures sont réglées 55ºC et 95ºC.
• 7.2.3 Mettre en marche le cycleur/détecteur du syst me BAX® (effectuer la vérification, si demandé).
• 7.2.4 Créer un fichier de support.
• 7.2.5 Sélectionner RUN FULL PROCESS dans la barre de menu pour réchauffer le cycleur/détecteur.

7.3 Préparation des échantillons

• 7.3.1 Lyse des échantillons
  • 7.3.1.1 Placer le nombre voulu de tubes de lyse (un pour chaque échantillon et un pour le témoin) dans le support selon le fichier de support.
  • 7.3.1.2 Préparer le réactif de lyse en pipettant 150 μL de protéase dans une bouteille de tampon de lyse de 12 ml.
  • 7.3.1.3 Ajouter 200 μL de réactif de lyse dans chaque tube de lyse.
  • 7.3.1.4 Transférer 5 μL d'échantillon enrichi au tube de lyse correspondant.
  • 7.3.1.5 Bien fermer les bouchons et chauffer les tubes à 55oC pendant 60 minutes, puis à 95oC pendant 10 minutes.
  • 7.3.1.6 Placer les tubes de lyse dans le bloc de refroidissement pendant au moins 5 minutes.
• 7.3.2 Préparer les échantillons pour la PCR
  • 7.3.2.1 Placer le support de tubes PCR dans le bloc de refroidissement PCR.
  • 7.3.2.2 Placer un tube PCR pour chaque échantillon dans le support.
  • 7.3.2.3 Retirer et jeter le couvercle d'une bandelette de tubes la fois.
  • 7.3.2.4 Utiliser une pipette canaux multiples pour transférer 50 μL de chaque échantillon lysé dans un tube PCR correspondant.
  • 7.3.2.5 Reboucher les tubes avec une nouvelle bandelette de bouchon optique et bien refermer. Répéter pour tous les échantillons.
  • 7.3.2.6 Déposer le bloc entier de refroidissement dans le cycleur/détecteur. Les échantillons devraient rester dans le bloc de refroidissement jusqu'à ce que le cycleur/détecteur soit prêt à être chargé, mais pour une période n'excédant pas 30 minutes après l'hydratation de la tablette.

7.4 Traitement des échantillons

Suivre à l'écran les directives de l'assistant PCR pour charger vos échantillons, exécuter le programme, puis retirer vos échantillons, tel que précisé dans le Guide d'utilisation.

7.5 Analyse des résultats

7.6 Confirmation des résultats positifs

A partir du bouillon d'enrichissement secondaire, procéder avec les étapes d'ensemencement de géloses et de confirmation tel que décrit dans la méthode de culture (MFHPB-07 ou MFHPB-30)

8. Références

8.1 Pagotto F., Hébert, K., J. Farber . 2011. Isolement de Listeria monocytogenes dans les aliments et les échantillons (MFHPB-30). Volume 2. Compendium de méthodes. http://www.hc-sc.gc.ca/food-aliment

8.2 Official Methods of Analysis (2002), 17th edition. AOAC INTERNATIONAL, Gaithersburg, MD, section 993.12.

8.3 US Department of Agriculture, Food Safety and Inspection Service, Office of Public Health and Science. Microbiology Laboratory Guidebook [Internet]. Washington: The Dept; c2002 [révisé le 29 avril; cité le 22 juillet 2002]. Chapter 8, Isolation and Identification of Listeria monocytogenes from Red Meat, Poultry, Egg and Environmental Samples [environ 20 écrans]. Disponible à l'adresse suivante :  http://www.fsis.usda.gov/OPHS/microlab/mlgchp803.pdf

8.4 US Food & Drug Administration, Center for Food Safety & Applied Nutrition. Bacteriological Analytical Manual Online [Internet]. Washington: The Admin; c2001 [révisé le 1er avril; cité le 22 juillet 2002]. Chapter 10, Listeria monocytogenes [environ 12 écrans]. Disponible à l'adresse suivante :  http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-10.html

8.5 Warburton, D., Boville, A., Pagotto, F., Daley, E. and Chow, C. 2011. Isolement de Listeria monocytogenes et autres Listeria spp.dans les aliments et les échantillons environnementaux (MFLP-07). Volume 2. Compendium de Méthodes. http://www.hc-sc.gc.ca/food-aliment

8.6 Comité des méthodes. 2010 Échantillonnage environnemental pour la détection des microorganismes (MFLP-41). Volume 3. Compendium de méthodes. http://www.hc-sc.gc.ca/food-aliment

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