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Méthode du système Qualicon Bax® pour la détection de Salmonella dans une variété d'aliments et des échantillons du milieu
Procédure de laboratoire
MFLP-29
Octobre 2011
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(Version PDF - 91 ko)Direction générale des produits de santé et des aliments
Ottawa
Comité des méthodes microbiologiques
Division de l'évaluation microbiologique
Bureau des dangers microbiens, Direction des aliments
Direction générale des produits de santé et des aliments
Repère postal : 2204E
Ottawa ON K1A 0K9
Courriel : micro_methods_committee @hc-sc.gc.ca
1. Application
Cette méthode est applicable à la détection de Salmonella dans une variété d'aliments, notamment la viande, la volaille, le poisson et les fruits de mer, les fruits et légumes, les produits laitiers, divers produits alimentaires, ainsi que des échantillons du milieu.
2. Description
Le système BAX® est un instrument pratique de dépistage oui/non de la présence de Salmonella dans une variété d'aliments; ce système utilise la technologie de la réaction en chaîne de la polymérase (PCR) pour l'amplification rapide et la détection par fluorescence. Après une étape de préenrichissement d'une durée de 22 à 26 heures (et une étape de régénération de trois heures pour certains types d'aliments ou un enrichissement secondaire pendant la nuit dans le bouillon TT/RVS), la préparation des échantillons requiert environ une heure du temps de l'utilisateur. La procédure automatisée donne des résultats fiables dans un délai d'environ quatre heures.
La trousse d'analyse a été modifiée pour ajouter la technologie « hot start », mais le reste de l'essai demeure le même. La version « hot start » de la trousse d'analyse, essai PCR du système BAX® pour Salmonella 2, est interchangeable avec l'essai PCR du système BAX® original pour Salmonella. Le système BAX® est conçu pour être utilisé par un personnel de laboratoire qualifié qui suit les procédures normalisées de microbiologie.
3. Principe
Le système BAX® utilise la technologie de la réaction en chaîne de la polymérase (PCR) pour amplifier trois (3) fragments précis de l'ADN bactérien qui sont stables et non affectés par l'environnement de croissance. Les trois (3) fragments sont des séquences génétiques uniques de Salmonella; par conséquent, la méthode constitue un indicateur très fiable de la présence de cet organisme. Le système BAX® automatisé utilise ensuite la détection par fluorescence pour analyser le produit de la PCR et pour déterminer si les résultats sont positifs ou négatifs.
La PCR représente un moyen puissant d'offrir rapidement des millions de copies d'un fragment précis d'ADN. Dans une application typique, on combine l'échantillon d'ADN à une polymérase, des nucléotides et des amorces spécifiques à une séquence donnée de nucléotides. Ce mélange est alors soumis à une série de cycles chronométrés de chauffage et de refroidissement. Le chauffage dénature ou sépare l'ADN en brins distincts. Au fur et à mesure que le mélange refroidit, les amorces reconnaissent la séquence cible d'ADN et s'y fixent par annelage. L'ADN polymérase utilise ensuite les nucléotides pour étendre les amorces, ce qui a pour effet de créer deux copies du fragment d'ADN cible. Des cycles répétés de dénaturation, d'hybridation et d'élongation produisent des augmentations exponentielles du nombre de fragments d'ADN cibles en quelques heures à peine. Si la séquence cible n'est pas présente, il ne se produit aucune amplification détectable.
Le système BAX® simplifie ce processus en combinant les amorces, la polymérase, les nucléotides et le témoin positif dans une seule tablette d'échantillon déjà emballée dans des tubes PCR. De plus, la détection automatique par fluorescence permet les tests en tubes fermés, éliminant virtuellement la possibilité de contamination entraînée avec l'ADN amplifié.
4. Définition des termes
Voir l'annexe A du volume 3.
5. Prélèvement des échantillons
Voir l'annexe B du volume 3.
6. Matériel et équipements spéciaux
Les milieux et les réactifs énumérés ci après sont disponibles dans le commerce et ils doivent être utilisés, préparés et/ou stérilisés selon les instructions du fabricant. Voir aussi l'annexe G du volume 3 pour la formulation de la majorité des milieux individuels.
1) Fournis avec la trousse - (Salmonella n° D11000133, Salmonella 2 n° D17710608; chaque permettent d'effectuer 96 tests; DuPont Qualicon, Téléphone : 1 800-863-6842, Télécopieur : 302-695-5301)
Guide d'utilisation du système BAX®
2) Bouillons d'enrichissement et de régénération - varient selon le type d'aliment (voir la section 7)
Bouillon d'eau peptonée tamponnée
Bouillon d'eau peptonée tamponnée + novobiocine (pour les pousses)
Bouillon lactosé
Bouillon d'infusion de cerveau et de cœur (BHI)
Solution aqueuse au vert brillant
Poudre de lait écrémé
3) Équipement
Stomacher
Incubateur capable de maintenir des températures de 35 et 42 °C
Autres (fournis avec la trousse de démarrage du système BAX®)
Cycleur/détecteur avec plaques de vérification
Poste de travail informatique avec le système d'exploitation Microsoft Windows®, le logiciel du système BAX® et une imprimante
Blocs de chauffage avec dispositif d'ancrage à thermomètres pour les tubes de lyse
Outils de capsulage/décapsulage
Pipettes variées pour le transfert des réactifs et des échantillons
Blocs de refroidissement avec dispositif d'ancrage pour les tubes de lyse et les tubes PCR
Supports pour tubes PCR
Fournitures
Tubes de lyse avec bouchons et supports
Embouts de pipette
Gants de nitrile sans poudre
7. Marche à suivre
7.1 Prélèvement et enrichissement des échantillons
Préparer les échantillons selon une méthode normalisée pour le type d'aliment, comme suit :
Type d'échantillon |
Pré-enrichissement |
Enrichissement ou régénération |
|---|---|---|
| Viande et volaille crue* | Mélanger 25 g d'échantillon dans 225 mL de bouillon d'eau peptonée tamponnée. Incuber à 42 °C pendant 24 heures. | Ajouter 10 μL d'échantillon enrichi à 500 μL de bouillon de BHI (à la température ambiante). Incuber à 37°C pendant trois (3) heures. Passer à l'étape 7.3.1.4 |
| Viande transformée crue** | Mélanger 25 g d'échantillon dans 225 mL de bouillon d'eau peptonée tamponnée. Incuber à 35°C pendant 20 à 24 heures. | Ajouter 10 μL d'échantillon enrichi à 500 μL de bouillon de BHI (à la température ambiante). Incuber à 37°C pendant trois (3) heures. Passer à l'étape 7.3.1.4 |
| Échantillons du milieu (p. ex. écouvillons, tampons et plateaux à viande) | Incuber l'échantillon dans le bouillon d'eau peptonée tamponnée à 35°C pendant 20 à 24 heures. | Ajouter 10 μL d'échantillon enrichi à 500 μL de bouillon de BHI (à la température ambiante). Incuber à 37°C pendant trois (3) heures. Passer à l'étape 7.3.1.4 |
| Oeufs | Mélanger 25 g d'échantillon dans 225 mL de bouillon d'eau peptonée tamponnée. Incuber à 35°C pendant 20 à 24 heures. | Ajouter 10 μL d'échantillon enrichi à 500 μL de bouillon de BHI (à la température ambiante). Incuber à 37°C pendant trois (3) heures. Passer à l'étape 7.3.1.4 |
| Pousses | Mélanger 25 g d'échantillon dans 225 mL de bouillon d'eau peptonée tamponnée avec novobiocine. Incuber à 42°C pendant 20 à 24 heures. Novobiocine : Mélanger la novobiocine et l'eau distillée pour obtenir une solution de 20 mg/mL. Stériliser par filtration à l'aide d'un filtre 0,2 μm, puis transférer 1 mL de la solution de novobiocine dans un litre de bouillon d''eau peptonée tamponnée refroidie (<50°C). Le pH final doit être 7.2+/- 0.2. |
Ajouter 10 μL d'échantillon enrichi à 500 μL de bouillon de BHI (à la température ambiante). Incuber à 37°C pendant trois (3) heures. Passer à l'étape 7.3.1.4 |
| Produits laitiers | 1. Pour le lait liquide, la crème glacée, les produits en poudre (lactosérum et babeurre) et la poudre de lait écrémé, mélanger 25 g d'échantillon dans 225 mL de solution aqueuse au vert brillant. Pour le fromage et les autres produits laitiers, mélanger 25 g d'échantillon dans 225 mL de bouillon d'eau peptonée tamponnée. 2. Ajuster le pH à 6.0 - 7.0 3. Incuber le fromage de lait cru à 42°C et les autres mélanges de produits laitiers à 35°C pendant 22 à 26 heures. |
1.Transférer 0,1 mL et 1,0 mL de bouillon peptoné tamponné dans 9,0 mL de bouillons RVS et TBG. 2. Incuber à 42.5°C pendant 22 à 26 heures. 3. Combiner 2 mL de chaque bouillon et mélanger. Passer à l'étape 7.3.1.4 |
| Poisson et fruits de mer | Mélanger 25 g d'échantillon dans 225 mL de bouillon lactosé. Laisser reposer pendant 55 à 65 minutes à la température ambiante. Ajuster le pH à 6,8 ± 0,2. Incuber à 35°C pendant 22 à 26 heures. | Aucune étape d'enrichissement ou de régénération. Passer à l'étape 7.3.1.4 |
| Friandises et enrobage de friandises (y compris le chocolat) | Mélanger 25 g d'échantillon avec 225 mL de solution de poudre de lait écrémé reconstitué. Laisser reposer pendant 55 à 65 minutes à la température ambiante. Ajuster le pH à 6,8 ± 0,2. Ajouter 0,45 mL de vert brillant (1,0 % w/v) et incuber à 35°C pendant 22 à 26 heures. | Ajouter 10 μL d'échantillon enrichi à 500 μL de bouillon de BHI (à la température ambiante). Incuber à 37°C pendant trois (3) heures. Passer à l'étape 7.3.1.4 |
| Cantaloup | 1. Placer le cantaloup entier dans un sac à Stomacher et ajouter du bouillon d'eau peptonée tamponnée (jusqu'à 1,5 fois le poids du cantaloup). Lorsque l'analyse est effectuée sur un plus gros cantaloup (~2 kg), un volume moins important de bouillon d'eau peptonée tamponnée peut être utilisé, pourvu qu'un volume suffisant de bouillon d'eau peptonée tamponnée est ajouté pour submerger entièrement le fruit. 2. Mélanger pendant 30 secondes en frottant manuellement la croute. 3. Submerger le fruit et laisser reposer pendant 30 minutes à la température ambiante, puis frotter de nouveau manuellement la croute. 4. Ajuster le pH à 6.0 - 7.0 5. Incuber à 35°C pendant 20 à 24 heures. Ajouter un poids sur l'extérieur du sac à Stomacher pour veiller à ce que le fruit demeure submergé durant l'incubation. |
1.Transférer 0,1 mL et 1,0 mL de bouillon peptoné tamponné dans 9,0 mL de bouillons RVS et TBG. 2. Incuber à 42,5°C pendant 22 à 26 heures. 3. Combiner 2 mL de chaque bouillon et mélanger. Passer à l'étape 7.3.1.4 |
| Autres aliments | Mélanger 25 g d'échantillon dans 225 mL du bouillon d'enrichissement approprié pour le type d'aliment, conformément aux spécifications du MFHPB-20 ou du chapitre 5 du FDA-BAM. | Ajouter 10 µL d'échantillon enrichi à 500 µL de bouillon de BHI (à la température ambiante). Incuber à 37°C pendant trois (3) heures. Passer à l'étape 7.3.1.4 |
| Méthode de rechange : tout aliment non énuméré plus haut | Mélanger 25 g d'échantillon dans 225 mL du bouillon d'enrichissement approprié pour le type d'aliment, conformément aux spécifications de la méthode ISO 6579. | Exceptions : viande, volaille, poisson et fruits de mer) Ajouter 10 μL d'échantillon enrichi à 500 μL de bouillon de BHI (à la température ambiante). Incuber à 37°C pendant trois (3) heures. Passer à l'étape 7.3.1.4 |
* Viande crue : toute viande crue NE CONTENANT PAS d'épices, d'agents de remplissage ou de saveurs ajoutées.
** Toute viande transformée et toute viande crue CONTENANT des épices, des agents de remplissage et des saveurs ajoutées.
Exemples de viandes transformées : croquettes de poulet, saucisses, miettes de bacon, poulet avec assaisonnement pour barbecue et hambourgeois préparés.
7.2 Préparation de l'équipement (Consulter le Guide d'utilisation du système BAX® pour obtenir des détails supplémentaires)
7.2.1 S'assurer que les blocs de refroidissement ont été réfrigérés pendant la nuit.
7.2.2 Faire chauffer les blocs de chauffage et s'assurer que les températures sont réglées à 37 ºC et 95 ºC.
7.2.3 Mettre en marche le cycleur/détecteur du système BAX® (effectuer la vérification, si demandé).
7.2.4 Créer un fichier de support.
7.2.5 Sélectionner RUN FULL PROCESS dans la barre de menu pour réchauffer le cycleur/détecteur.
7.3 Préparation des échantillons
7.3.1 Lyser des échantillons
7.3.1.1 Placer le nombre voulu de tubes de lyse (un pour chaque échantillon et un pour le « témoin »; voir le manuel BAX® pour une explication du mot « témoin ») dans le support conformément au fichier de support.
7.3.1.2 Préparer le réactif de lyse en pipettant 150 µL de protéase dans une bouteille de tampon de lyse de 12 mL. La solution de réactif de lyse peut être entreposée au réfrigérateur pendant une période maximale de deux (2) semaines.
7.3.1.3 Ajouter 200 µL de réactif de lyse dans chaque tube de lyse.
7.3.1.4 Après les étapes appropriées de préenrichissement et d'enrichissement ou de régénération énoncées dans le tableau 1 (7.1), transférer 5 µL d'échantillon enrichi dans le tube de lyse correspondant.
7.3.1.5 Bien fermer les bouchons et chauffer les tubes à 37°C pendant 20 minutes, puis à 95°C pendant 10 minutes.
7.3.1.6 Placer les tubes de lyse dans le bloc de refroidissement pendant au moins 5 minutes.
7.3.2 Préparer les échantillons pour la PCR
7.3.2.1 Placer le support à tubes PCR dans le bloc de refroidissement PCR.
7.3.2.2 Placer un tube PCR pour chaque échantillon dans le support.
7.3.2.3 Retirer et jeter le couvercle d'une bandelette de tubes à la fois.
7.3.2.4 Utiliser une pipette à canaux multiples pour transférer 50 μL de chaque échantillon lysé dans un tube PCR correspondant.
7.3.2.5 Reboucher les tubes avec une nouvelle bandelette de bouchon optique et bien refermer. Répéter pour tous les échantillons.
7.3.2.6 Déposer le bloc entier de refroidissement dans le cycleur/détecteur. Les échantillons devraient rester dans le bloc de refroidissement jusqu'à ce que le cycleur/détecteur soit prêt à être chargé, mais pendant une période n'excédant pas 30 minutes après l'hydratation de la tablette.
7.4 Traitement des échantillons
Suivre à l'écran les directives de l'assistant PCR pour charger vos échantillons, exécuter le programme, puis retirer vos échantillons, tel que précisé dans le Guide d'utilisation.
Certains hyperliens donnent accès à des sites d'un organisme qui n'est pas assujetti à la 
Loi sur les langues officielles. L'information qui s'y trouve est donc dans la langue du site.
7.5 Analyse des résultats
Légende :
Vert - résultat négatif
Rouge - résultat positif
Jaune - résultat indéterminé
Jaune avec barre rouge - erreur
7.6 Confirmation des résultats positifs
Les résultats positifs doivent être confirmés par cultures, conformément aux exigences de la procédure MFHPB-20. Ensemencer les plaques des géloses sélectives spécifiées et confirmer à l'aide de méthodes biochimiques et sérologiques.
8.0 Références
8.1 Santé Canada, 1998. MFHPB-20. Méthodes pour l'isolement et l'identification des salmonelles dans les aliments. Compendium de méthodes, volume 2, Ottawa.
8.2 Comité technique 34 (ISO 6579 :2002). Méthode horizontale pour la recherche des Salmonella spp. Organisation internationale de normalisation. Microbiologie des aliments et de la moulée animale. 4e édition). Organisation internationale des normes : Genève.
8.3 US Department of Agriculture 2001. Chapitre 4, Isolation and Identification of Salmonella from Meat, Poultry, and Egg Products. Microbiology Laboratory Guidebook . Washington.
8.4 US Food & Drug Administration, Center for Food Safety & Applied Nutrition. 2001. Chapitre 5, Salmonella. Bacteriological Analytical Manual. Washington.
FIN DU DOCUMENT
