MFLP-32 Identification des espèces de Salmonella au moyen de la technologie pcr en temps réel du système de détection rapide de pathogènes Adiafood

Si vous avez besoin d'aide pour accéder aux formats de rechange, tels que Portable Document Format (PDF), Microsoft Word et PowerPoint (PPT), visitez la section d'aide sur les formats de rechange.

Certains hyperliens donnent accès à des sites d'un organisme qui n'est pas assujetti à la Loi sur les langues officielles. L'information qui s'y trouve est donc dans la langue du site.

Procédure de laboratoire MFLP-32
mai 2011

Direction générale des produits de santé et des aliments
Ottawa

Comité des méthodes microbiologiques
Division de l'évaluation
Bureau des dangers microbiens
Direction des aliments
Repère postal : 2204E
DGPSA, Ottawa, Ontario, K1A 0K9

Courriel : micro_methods_committee@hc-sc.gc.ca

1. Application

Cette méthode s'applique à l'identification rapide des espèces de Salmonella isolées dans les aliments et autres échantillons, au moyen des techniques classiques de culture de Salmonella, MFHPB-20 (8.1), MFLP-75 (8.2), d'autres méthodes de la DGPSA et d'autres méthodes de détection de Salmonella non incluses dans le Compendium. Cette méthode peut être appliquée à l'identification présomptive des Salmonella dans des cultures de bouillons d'enrichissement. Si des mesures de conformité fondées sur les produits sont prévues, et lorsque stipulé, la méthodologie de la DGPSA, MFHPB-20 (8.1), MFLP-75 (8.2 ou l'équivalent est utilisée pour la confirmation finale des échantillons présumés positifs obtenus par la par la PCR en temps réel ADIAFOOD.

Cette méthode révisée remplace la méthode MFLP-32 datée de janvier 2010.

2. Principe

Après les procédures d'enrichissement des échantillons, bouillon de pré-enrichissement (PE) pour la moulée animale, les fertilisants et les échantillons environnementaux ou bouillon sélectif d'enrichissement (SE) pour les aliments et les ingrédients alimentaires, les bouillons sont soumis à la réaction PCR en temps réel qui amplifie et détecte l'ADN pathogène ciblé à l'aide d'amorces et de phares moléculaires spécifiques. Les phares moléculaires sont des séquences uniques permettant l'identification du pathogène à un degré de spécificité élevé. Une fois liés à leur cible, les phares moléculaires émettent un signal fluorescent, proportionnel à la quantité d'ADN pathogène amplifié. Si la bactérie ciblée est absente de l'échantillon alimentaire, aucun signal fluorescent n'est détecté car les amorces sont hautement spécifiques aux espèces de Salmonella et n'amplifient pas l'ADN provenant d'autres organismes non-Salmonella dans les mêmes conditions de réaction.

La procédure complète, après les étapes d'enrichissement (PE, SE), permet d'identifier en 3 heures les échantillons positifs présomptifs et peut remplacer les tests habituels de dépistage et de confirmation, fournissant ainsi une économie considérable de temps, de main d'oeuvre et coût d'analyse. Cette technique PCR en temps-réel s'est révélée une méthode spécifique et sensible pour l'identification des espèces de Salmonella à partir de divers échantillons (8.3).

Le système de détection rapide de pathogènes ADIAFOOD par PCR en temps réel pour Salmonella spp. a été validé par l'AOAC-RI et a reçu le statut de « Performance Tested Method » en 2004, Numéro du certificat : 070402.

ADIAFOOD* est une marque déposée  d'AES Chemunex [en anglais seulement]; (Rue Maryse Bastié • Ker Lann, CS 17219 • F-35172 Bruz Cedex, Phone: 33 (0)2 23 50 12 12, Fax: 33 (0)2 23 50 12 00, www.aes-lab.com) . *La marque déposée est en suspens au Canada.

3. Définition des termes

Voir l'annexe A du volume 3.

4. Prélèvement des échantillons

Voir l'annexe B du volume 3.

5. Amorces spécialisées, Réactifs, Tampons, Matériel et équipement

Note : Il est de la responsabilité du superviseur du laboratoire de voir à ce que l'analyse décrite dans cette méthode soit réalisée en accord avec la Norme Internationale intitulée « ISO/IEC 17025:1999 (ou version plus récente): Prescriptions générales concernant la compétence des laboratoires d'étalonnages et d'essais ».

5.1 Matériel et équipement

5.1.1 Composantes de la trousse ADIAFOOD

• Tampon d'extraction (EX-1)
• Réactif d'extraction, lyophilisé (EX-2)
• Tampon de détection (DT-1)
• Réactif de détection, lyophilisé (DT-2)
• Microplaques de détection ou barrettes de tubes contenant les réactifs PCR pré-distribués
• Barrettes de contrôle PCR (seulement avec les trousses de barrettes de détection)
• Bouchons PCR de qualité optique

Note: Toutes les trousses sont produites par  AES Chemunex Canada, www.aeschemunex.com et distribuées au Canada par  Innovation Diagnostics [en anglais seulement], www.innovationdiagnostics.com , 1-888-965-1871.

5.1.2 Consommables additionnels et équipements requis

• Thermocycler PCR en temps réel validé par AES^*
• Thermocycler conventionnel pour l'extraction de l'ADN (facultatif)
• Centrifugeuse comprenant rotor et support de microplaque
• Vortex adapté aux microplaques
• Deux pipettes à multicanaux
• Pipette à canal simple
• Enceinte PCR (optionel)
• Fermoir PCR
• Supports à barrettes
• Trousse d'extraction ADIAFOOD (contenant les plaques d'extraction, bouchons bombés et films scellant)
• Embouts de pipettes avec filtre
• Bassins jetables pour pipettes à multicanaux
• Tubes stériles (2 ml) à bouchon vissable pour microcentrifugation
• Gants sans poudre
• Milieu(x) d'enrichissement requis
• Sacs Stomacher avec filtre
• Pipettes sérologiques jetables
• Alcool dénaturé et eau de Javel

*Spécifications du thermocycleur PCR en temps réel : capacité d'analyser une microplaque ''low'' et ''high profile'' de 96 (48) puits ou 96 (48) tubes PCR ''low'' et ''high profile'' de 0,2 ml et la capacité d'exciter des fluorophores ayant un pic d'excitation de 485 à 520 nm et de détecter des fluorophores ayant un pic d'émission de 500 à 600 nm.

5.2 Marqueurs moléculaires, programme des cycles de température, tampons et réactifs

5.2.1 Marqueurs moléculaires

Les amorces et les phares moléculaires sont fournis dans la trousse et leur spécificité pour Salmonella spp. a été vérifiée (8.3).

5.2.2 Programmes des cycles de température

Les programmes des cycles de température de la réaction PCR incluent un cycle automatisé d’extraction favorisant la lyse des cellules bactériennes suivi d’un programme automatisé de détection.

5.2.3 Tampons et réactifs

Tous les tampons et les réactifs sont fournis par AES Chemunex. La trousse inclut les tampons et réactifs requis pour l’extraction (EX-1, EX-2) et les tampons et réactifs de détection (DT-1, DT-2). Tous les autres réactifs de détection sont déjà pré-distribués dans les puits de la microplaque ou Barrettes de détection. L'eau, les micropipettes, les embouts de pipette et tout le matériel entrant en contact avec les échantillons ou les réactifs PCR devraient être stériles et sans ADNase et/ou autoclavés avant usage afin d'éliminer toute trace d'ADNase ou d'autres contaminants.

6. Marche à suivre

6.1 Manipulation des échantillons

Les échantillons sont préparés et enrichis selon la méthode de culture classique pour l’isolement des Salmonella (8.1, 8.2) ou par d’autres méthodes validées pour l’isolement des Salmonella. Prélever une portion du bouillon d’enrichissement et la soumettre à la procédure PCR, tel qu’indiqué ci-dessous. Des puits de contrôles positifs et de contrôles négatifs sont aussi soumis à l’analyse avec chaque groupe d’échantillons.

6.2 Extraction de l’ADN

6.2.1 Vider le contenu de la bouteille EX-1 (bouteille de plastique souple) dans la fiole EX-2 pour obtenir la solution EX-2 reconstituée.

6.2.2 Refermer la fiole EX-2 et agiter par inversion pour assurer la dissolution complète du réactif déshydraté.

6.2.3 Verser la solution EX-2 reconstituée dans un bassin pour pipette à multicanaux.

6.2.4 Aliquoter 90 µL de la solution EX-2 reconstituée dans chaque puits de la microplaque d’extraction (2 puits par échantillon).

6.2.5 Transférer 10 µL de la suspension cellulaire (étape 6.1) dans les puits de la microplaque d’extraction selon le schéma d’affectation prédéterminé.

6.2.6 Sceller les puits de la microplaque d’extraction avec les bandes de bouchons bombés fournies.

6.2.7 Placer la microplaque d’extraction dans le thermocycleur

6.2.8 Débuter le programme d’extraction de l’ADN du thermocycleur.

6.2.9 Lorsque le programme d’extraction est complété, retirer la microplaque d’extraction. Tous les microorganismes sont maintenant lysés et inactivés.

6.2.10 Centrifuger la microplaque d’extraction pendant 5 minutes à une vitesse de 1,800 × g. Le surnageant peut maintenant être utilisé pour la méthode de détection (amplification) par PCR.

6.3 Méthode de détection (amplification) par PCR

6.3.1 Vider le contenu de la bouteille DT-1 (bouteille de plastique souple) dans la fiole DT-2 pour obtenir la solution DT-2 reconstituée.

6.3.2 Refermer la fiole DT-2 et agiter par inversion pour assurer la dissolution complète du réactif déshydraté.

6.3.3 Verser la solution DT-2 reconstituée dans un bassin pour pipette à multicanaux.

6.3.4 Retirer une microplaque de détection ou le nombre requis de barrettes de détection de l’enveloppe.

6.3.5 Aliquoter 15 µL de la solution DT-2 reconstituée dans la microplaque de détection ou dans les barrettes.

6.3.6 Transférer 10 µL d’extrait d’ADN provenant de chaque puits de la microplaque d’extraction dans les puits de la microplaque ou des barrettes de détection.

6.3.7 Sceller la microplaque de détection ou les barrettes de détection avec les bouchons optiques pour PCR fournis.

6.3.8 Sceller la microplaque d’extraction en utilisant le film scellant fourni et l’entreposer à 4°C jusqu’à ce que l’analyse soit complétée.

6.3.9 Inverser vigoureusement la microplaque ou les barrettes, 4 fois, afin de permettre un brassage adéquat des réactifs dans les puits.

6.3.10 Tapoter la microplaque légèrement afin d’éliminer les bulles d’airs dans les puits.

6.3.11 Agiter la microplaque ou barrettes de détection à l’aide du vortex, à vitesse maximale, pendant 1 minute.

6.3.12 Centrifuger la microplaque ou les Barrettes de détection pendant 1 minute à 1800 × g afin d’assurer que les réactifs PCR ainsi que l’échantillon d’ADN se retrouvent bien au fond des puits de la microplaque PCR.

6.3.13 Bien fixer la microplaque ou les barrettes de détection dans l’appareil PCR. S’assurer que le puits A1 se retrouve dans le coin supérieur gauche et sélectionner l’icône « Start Detection » pour débuter le protocole d’analyse.

6.3.14 Lorsque le programme de détection sera complété, enlever la microplaque ou les barrettes de détection de l’appareil et les jeter.

7. Interprétation des résultats

Les amplicons (produits de la réaction PCR) générés à partir des séquences cibles de Salmonella par la présente méthode PCR sont des fragments d'ADN double brin. Lors d’un résultat PCR positif, la réponse mesurée par fluorescence sera plus élevée que celle du seuil de référence exprimé par les témoins négatifs en moins de 40 cycles d’amplification de la réaction PCR. La valeur seuil de référence de la fluorescence est déterminée et établie par le système. Un résultat négatif n’émettra normalement pas de fluorescence. S’il y a émission de fluorescence au-dessus de la valeur seuil de référence dans les témoins négatifs, les résultats du test ne sont pas valides et l’analyse doit être refaite après avoir pris soin d’éliminer toutes les sources d’erreur possibles. Tout échantillon trouvé positif au moyen de la technique PCR ADIAFOOD doit être confirmé en procédant à une culture, surtout si des mesures de conformité sont prévues.

8. Références

8.1 D’Aoust, J.-Y. et U. Purvis. 1998. MFHPB-20. Isolement et identification des Salmonella dans les aliments. Dans: Volume 2, Compendium de méthodes.

8.2 Poppe, C. et E. D. Mann, 1998. MFLP-75. Méthode d'isolement des espèces du genre Salmonella sur milieu modifié semi-solide de Rappaport-Vassiliadis (MSRV). Dans: Volume 3, Compendium de méthodes.

8.3 Archambault, C., Plante, D. et M.C. Gagnon, Warnex Inc. 2002. Validation de la technique PCR en temps réel pour l’identification rapide des espèces de Salmonella dans les aliments et autres échantillons. Communication personnelle (données non publiées).

FIN DU DOCUMENT