Détection des Listeria spp. dans les aliments et les échantillons environnementaux par la méthode VIP

Procédure de laboratoire MFLP-34
Février 2011

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Don Warburton et Ann Boville
Bureau des dangers microbiens, Direction des Aliments
Repère postal : 2204AE
Santé Canada, Ottawa ON K1A 0K9

Courriel : micro_methods_committee@hc-sc.gc.ca

1. Application

Cette méthode s'applique à la détection rapide des Listeria spp dans les aliments et les échantillons environnementaux afin de déterminer s'il y a conformité avec les articles 4 et 7 de la Loi sur les aliments et drogues. Cette méthode a été validée pour l'utilisation avec les viandes crues, les fruits de mer cru non transformés, les légumes frais congelés, le fromage fait de lait non pasteurisé, et les échantillons environnementaux. Un nombre insuffisant de données de validation on été reçu pour les produits laitiers traités à la chaleur, les poissons transformés, viande prête-à-manger, et des aliments divers. Cette méthode révisée remplace la méthode MFLP-34 datée de janvier 2004.

NOTE: Même si cette méthode n'est approuvée que pour certains produits alimentaires, énumérés ci-dessus, il peut-être assumé que cette méthode pourrait être utilisée avec d'autres produits alimentaires. Pour s'assurer que la méthode convient pour l'utilisation visée avec d'autres produits alimentaires, il est impératif que la méthode soit correctement validée avec ces autres produits selon les lignes directrices dans le Compendium des méthodes analytiques. Le cas échéant nous demandons de transmettre ces données de validation au Comité des Méthodes de Microbiologie afin que nous puissions réviser la portée d'application de la méthode à la lumière de ces nouvelles données à condition que celles-ci répondent aux critères d'acceptabilité du CMM (voir Élaboration de méthodes dans le volume 1 du Compendium de méthodes).

2. Description

La méthode VIP pour Listeria est un essai d'immunoprécipitation visuelle qui permet de détecter la présence de Listeria monocytogenes et les autres espèces de Listeria. Cette méthode emploie des anticorps hautement spécifiques qui visent des antigènes de Listeria et la formule en a été établie spécifiquement pour réduire au minimum la réactivité croisée tout en maintenant une sensibilité supérieure. La méthode a été modifiée par Warburton et coll. (8.3; et des données non publiées) afin de permettre l'utilisation d'un bouillon unique (le bouillon Palcam) comme milieu de pré-enrichissement pour tous les échantillons alimentaires et environnementaux.

3. Principe

La méthode VIP pour Listeria utilise un système de réactif exclusif pour former un complexe antigène-anticorps-chromogène en présence des Listeria. Cette méthode assure une très grande sensibilité et spécificité aux Listeria. On ajoute des échantillons enrichis de la façon requise à l'unité VIP; tout antigène Listeria se fixera au complexe anticorps chromogène en traversant une membrane de soutien. En présence de Listeria, le complexe antigène-anticorps-chromogène forme une ligne de détection dans la fenêtre de l'échantillon d'essai. L'échantillon continue de s'écouler le long de la membrane pour former une ligne témoin dans la fenêtre de vérification de l'essai, que l'échantillon contienne ou non des Listeria.

4. Définitions des termes

Voir l'annexe A du volume 3.

5. Prélèvement des échantillons

Voir l'annexe B du volume 3.

6. Matériel et équipements spéciaux

Les milieux suivants (2-6) sont disponibles commercialement et doivent être préparés et stérilisés selon les instructions du fabricant. Voir également l'annexe G du volume 3 et la référence 8.1 pour la formulation des milieux individuels.

1. La trousse d'essai VIP Listeria ( BioControl Systems Inc., site web: www.biocontrolsys.com)
   
   
2. Bouillon Palcam
   
   
3. Bouillon UVM 2
   
   
4. Gélose Palcam (ou gélose équivalente)
   
   
5. Gélose Oxford (ou gélose équivalente)
   
   
6. Géloses chromatogènes (facultatif):
   Géloses Rapid L. mono (Laboratoires Bio Rad)_
   Géloses Aloa (Laboratoire AES)
   
   
7. Une pipette calibrée pour distribuer 100 uL avec embouts jetable
   
   
8. Stomacher et sacs à stomacher, mélangeur ou équivalent
   
   
9. Bain-marie (95-100° C) ou un système équivalent
   
   
10. Incubateurs capables de maintenir 30°C et 35°C

7. Procédure

7.1 Manipulation des unités d'échantillonnage

7.1.1 Avant l'analyse au laboratoire, sauf dans le cas des aliments stables à température de la pièce, garder les unités d'échantillonnage au réfrigérateur ou au congélateur, selon la nature du produit. Faire dégeler les échantillons congelés dans un réfrigérateur, ou pendant une période et à une température qui empêchent la croissance ou la mort des micro-organismes.

7.1.2 Analyser les unités d'échantillonnage le plus tôt possible après leur arrivée au laboratoire.

7.2 Préparation pour l'analyse / Enrichissement primaire

7.2.1 Pour assurer que l'unité d'analyse soit vraiment représentative, agiter les liquides ou les solides fluides jusqu'à ce que le contenu soit homogène. Dans le cas d'un solide, prélever des portions à différents endroits de l'unité d'échantillonnage.

7.2.2 Ajouter 25 g ou ml de l'aliment (l'unité d'analyse) à 225 ml de bouillon Palcam dans une jarre de mélangeur ou dans un sac à stomacher. Dans le cas des échantillons composés, maintenir un ratio d'une partie d'échantillon pour 9 parties de bouillon Palcam.(Voir la Politique sur la présence de L. monocytogenes dans les aliments prêts-à-manger.) Presser les écouvillons environnementaux dans 10 ml d'agent neutralisant et ajouter cet échantillon à 90 ml de bouillon Palcam. Mélanger au broyeur, au stomacher ou au vortex selon les besoins pour obtenir un mélange complet et incuber à 35oC pendant 26 heures. Les éponge environnementales peuvent être ajoutées à 100 ml de bouillon Palcam ou être regroupées jusqu'à un maximum de 10 éponges avec 100 ml de bouillon Palcam par éponge (voir MFLP-41).

7.3 Enrichissement secondaire

7.3.1 Agiter le bouillon Palcam suffisamment pour le mélanger et laisser déposer les grosses particules d'aliment. Transférer 1.0 ml de bouillon Palcam dans 9.0 ml de bouillon UVM 2. Incuber à 30° C pendant 26 (minimum) à 48 heures.

7.3.2 Réfrigération des cultures d'enrichissement secondaire (UVM2) - FACULTATIF

La réfrigération des cultures d'enrichissement secondaire (UVM 2) assure au laboratoire une productivité et une flexibilité analytique plus grandes. Les cultures UVM 2 obtenues le vendredi à partir d'échantillons analysés le mercredi ou jeudi précédent sont réfrigérées pendant la fin de semaine. Le lundi suivant, le contenu des cultures UVM 2 réfrigérées est remis en suspension. Procéder de la façon décrite en 7.3.3 et 7.4.

7.3.3 Après incubation, transférer 2 ml du bouillon d'enrichissement dans un tube à essai et chauffer le tube durant 15 +/- 2 minutes au bain-marie à 100 ºC. Laisser refroidir le tube et effectuer l'essai VIP LIS (7.4). Conserver le bouillon d'enrichissement restant entre 2-8º C pour utilisation ultérieure de tests de confirmation à réaliser en cas d'essais VIP Listeria positifs.

7.4 Méthode d'essai VIP

7.4.1 Ouvrir l'enveloppe scellée contenant les unités VIP et prendre le nombre nécessaire. Il faut une unité par échantillon. Les unités VIP ne sont pas réutilisables. Assurez-vous de resceller immédiatement les unités VIP inutilisées dans l'enveloppe contenant un agent déshydratant. Garder à la température de la pièce, à un endroit frais et sombre.

7.4.2 Agiter doucement l'aliquot de 2 ml du bouillon d'enrichissement secondaire chauffé et laisser ensuite les particules d'aliments se déposer.

7.4.3 Transférer 0,1 ml du bouillon inoculé dans le puit d'échantillon.

7.4.4 Incuber à la température de la pièce pendant 10 minutes.

7.5 Lecture des résultats

7.5.1 Examiner l'unité VIP pour y déceler la présence d'une ligne distincte dans la fenêtre de vérification de l'essai. Cette ligne doit être sombre sur le fond blanc et s'étendre sur toute la fenêtre. L'absence de ligne témoin indique que le résultat du test n'est pas valide. Communiquer avec BioControl Technical Services.

7.5.2 Observer la fenêtre de l'échantillon d'essai. La présence d'une ligne distincte décrite ci-dessus indique un échantillon présumé positif. L'absence de ligne est un résultat négatif. Les intensités différentes des lignes d'essai et des lignes témoins sont acceptables tant qu'il y a présence d'une ligne témoin.

7.5.3 Il faut exécuter des cultures témoins positives et négatives pour se familiariser avec l'interprétation des résultats.

7.5.4 Autoclaver les unités à 121 C pendant 15 minutes avant de les jeter.

7.6 Confirmation des échantillons VIP positifs

7.6.1 Les résultats positifs présumés peuvent être, le cas échéant, confirmés par l'ensemencement et la confirmation du bouillon réfrigéré d'enrichissement secondaire selon les étapes décrites dans une méthode de culture tel que MFHPB-07 ou MFHPB-30.

NOTE : Si les résultats indiquent qu'aucune espèce de Listéria n'a été détectée, il est convenu que la présence de Listeria monocytogenes n'ait pas été révélée puisqu'aucune espèce appartenant au genre Listeria ne fut détectée. Toutefois, si un résultat positif pour Listeria spp. est obtenu à partir d'un écouvillonnage environnemental, on doit présumer qu'il est possible que Listeria monocytogenes soit présente, sans égard au nombre de colonies présumées testées ou au nombre d'essais de confirmation supplémentaires réalisés. Pour les échantillons environnementaux, rapporter toutes les espèces de Listeria identifiées.

8. Références

8.1 Atlas, R.M. 1997. Handbook of Microbiological Media . Second edition . L.C. Parks (editor). CRC Press Inc.

8.2 Santé Canada, Direction générale des produits de santé et des aliments, Direction des aliments. 2010. Politique sur la présence de Listeria monoctyogenes dans les aliments prêts-à-manger,

8.3 Pagotto, F., Hebert , K et J. Farber . 2011. Isolement de Listeria monocytogenes et autres Listeria spp. dans les aliments et échantillons environnementaux (MFHPB-30) Volume 2. Compendium des Méthodes. http://www.hc-sc.gc.ca/food-aliment.

8.4 A.M. Sewell, Warburton, D. W., Boville, A., Daley, E. F. and Mullen, K. 2002. A.Comparison of the Health Products and Food Branch and the Enzyme Linked Fluorescent Assay Methods for the Isolation and Identification of Listeria spp. from Foods. Int. J. Food Micro. In press.

8.5 Warburton, D., Boville, A., Pagotto, F., Daley, E. et Chow, C. 2011. Isolement de Listeria monocytogenes et des autres Listeria spp. dans les aliments et les échantillons environnementaux à l'aide du bouillon palcam (MFHPB-07). Volume 2. Compendium des Méthodes. http://www.hc-sc.gc.ca/food-aliment