Détection des entérotoxines de staphylocoques dans les produits alimentaires par la technique elfa (enzyme linked fluorescent assay) (vidas® staph enterotoxin ii (set2))

MFLP-65
Avril 2008

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Direction générale des produits de santé et des aliments
Ottawa

Don Warburton
le Comité des méthodes microbiologiques
Division de l'évaluation
Bureau des dangers microbiens
Direction des aliments
Repère postal : 2204A1
Ottawa (Ontario) K1A 0L2

Courriel: Don_Warburton@hc-sc.gc.ca

1. Application

Le VIDAS® Staph enterotoxin II est un essai qualitatif automatisé sur le système VIDAS, permettant la détection des entérotoxines de Staphylocoques dans les produits alimentaires (boîtes de conserves, liquides, déshydratés, produits laitiers, à base de viande, plats cuisinés et fruits de mer (AOAC n°0070404)) par la technique ELFA (Enzyme Linked Fluorescent Assay). L'essai VIDAS Staph enterotoxin II (SET2) est une méthode directe de tamisage de produits alimentaires pour la détection de sept toxines staphylococciques.

2. Principe

Le VIDAS Staph enterotoxin II est un essai immuno-enzymatique, permettant la détection d'entérotoxines de Staphylocoques par la méthode ELFA (Enzyme Linked Fluorescent Assay) grâce au système automatisé VIDAS (voir manuel d'Utilisation).

Le cône à usage unique (SPR®) sert à la fois de phase solide et de système de pipetage pour l'essai. L'intérieur du cône est recouvert d'anticorps monoclonaux de souris et de rat anti-entérotoxines adsorbés sur sa surface. Les autres réactifs de la réaction immunologique sont prêts à l'emploi et sont pré-distribués dans la cartouche.

Toutes les étapes sont réalisées automatiquement par l'instrument. Une aliquote extraite de l'aliment est placée dans la cartouche par l'utilisateur. Puis, successivement, le cône à usage unique SPR® subit des cycles d'aspiration/refoulement dont la durée a été spécifiquement calculée pour activer la réaction. Les antigènes présents dans l'échantillon vont se fixer sur les anticorps monoclonaux anti-entérotoxines fixés à l'intérieur du cône. Les éléments restés libres sont éliminés par lavage. Par la suite, les anticorps conjugués à la phosphatase alcaline aspirés dans le cône (puis refoulés) vont se fixer sur les entérotoxines staphylococciques, elles-mêmes immobilisées sur les anticorps de la paroi du cône.

Des étapes de lavage subséquentes éliminent le conjugué non fixé. Lors de l'étape finale de révélation, le substrat (4-Méthyl-ombelliferyl phosphate) est aspiré puis refoulé dans le cône ; l'enzyme du conjugué catalyse la réaction d'hydrolyse de ce substrat en un produit (4-Méthyl-ombelliferone) dont la fluorescence émise est mesurée à 450 nm. À la fin de l'essai les résultats sont analysés automatiquement par l'instrument qui fournit une valeur d'essai et un rapport imprimé pour chaque échantillon. Cette valeur est comparée à une référence interne (seuil) et chaque résultat est interprété (positif, négatif).

3. Definition

Voir Annexe A du Volume 2.

4. Prelevement echantillon

Voir Annexe B du Volume 2.

5. Materiel et reactifs necessaires

1. La trousse VIDAS SET2 (Ref 30 705) contient les réactifs nécessaires, incluant les standards et contrôles, pour l'analyse de 30 échantillons. La trousse est disponible auprès de bioMérieux Canada, Inc., 7815 Henri-Bourassa West, St. Laurent, Québec H4S 1P7. Tel: (514) 336 7321; Fax: (514) 336 6450
   
   
2. Appareil Vidas 30 pour une grande capacité ou mini Vidas pour une capacité réduite
   
   
3. Pipette à embout jetable permettant la distribution de 500 µl
   
   
4. Broyeur, ou Stomacher® pour sac à Stomacher de 400 ml
   
   
5. Tubes de centrifugation de 50 ml
   
   
6. Seringues (20 ml)
   
   
7. Papier pH
   
   
8. Acide trichloracétique (TCA) 90% (5,5N)
   
   
9. Tampon TRIS (0,3M pH 8,0)
   
   
10. Soude 1N et 4N
    
    
11. Acide chlorhydrique 5N

6. Procedure

Préparer l'essai en suivant les instructions suivantes:

6.1 Préparation des réactifs et pré-traitement de l'échantillon:

6.1.1 Préparation du tampon d'extraction:

Diluer la totalité du tampon d'extraction concentré de la trousse avec de l'eau distillée stérile de manière à obtenir 1 litre de solution prête à l'emploi. Homogénéiser. Conserver à 2-8°C pendant une durée n'excédant pas 3 mois.

Le tampon concentré peut également être dilué en un volume adapté en fonction de la fréquence d'utilisation (taux de dilution = 1/18).

6.1.2 Préparation de la solution d'acide trichloracétique à 90 %:

Dissoudre 90 g d'acide trichloracétique dans 40 ml d'eau déminéralisée. Ajuster le volume final à 100 ml avec de l'eau déminéralisée. La solution peut être conservée pendant 1 mois à 18-25°C.

6.1.3 Ajustement du pH des extraits:

Pour l'ajustement du pH des extraits alimentaires nous recommandons l'utilisation de papier indicateur de pH de type bandelettes à 3 zones de couleur, présentant des intervalles de pH de 0,5 unité ou moins.

6.2 Préparation des échantillons

6.2.1 Protocole général d'extraction:

• 6.2.1.1 Dans un sac à stomacher contenant 25 grammes d'aliment ajouter 25 ml de tampon d'extraction dilué comme indiqué précédemment.
  
  
• 6.2.1.2 Mélanger à haute vitesse pendant 3 minutes afin d'obtenir une suspension homogène.
  
  
• 6.2.1.3 Laisser reposer pendant 15 min. à 18-25°C.
  
  
• 6.2.1.4 Centrifuger l'échantillon mélangé dans la solution d'extraction pendant 15 min. à 3000-5000 x g à 18-25°C.
  
  
• 6.2.1.5 Récupérer le surnageant et le filtrer sur coton hydrophile humidifié placé à l'intérieur d'une seringue en utilisant le piston de la seringue.
  
  
• 6.2.1.6 Vérifier le pH du filtrat et l'ajuster si nécessaire entre pH 7,5 et 8,0 avec une solution de NaOH 1N.
  
  
• 6.2.1.7 Pipeter 500 µl de filtrat et les transférer dans le puits d'échantillon d'une cartouche VIDAS SET2 avant de mettre en marche l'appareil.

6.2.2 Aliments liquides:

• 6.2.2.1 Diluer les aliments concentrés selon les recommandations du fabricant.
  
  
• 6.2.2.2 Réajuster si nécessaire le pH entre 7,5 et 8,0 avec une solution de NaOH 1N.
  
  
• 6.2.2.3 Si un précipité est obtenu centrifuger et filtrer la suspension comme décrit dans le protocole général d'extraction.
  
  
• 6.2.2.4 Pipeter 500 µl de filtrat et les transférer dans puits d'échantillon d'une cartouche VIDAS SET2 avant de mettre en marche l'appareil.

6.2.3 Aliments déshydratés:

• 6.2.3.1 Réhydrater l'aliment avec le volume d'eau correspondant à son poids ou selon les recommandations du fabricant.
  
  
• 6.2.3.2 Laisser en contact une heure à température ambiante.
  
  
• 6.2.3.3 Peser 25 grammes de l'aliment réhydraté et ajouter 25 ml de tampon d'extraction reconstitué.
  
  
• 6.2.3.4 Procéder ensuite comme décrit dans le protocole général d'extraction (pour les poudres de lait écrémées, procéder selon le protocole 6.2.6 Produits laitiers).

6.2.4 Aliments en conserve (Contamination Post-Appertisation):

• 6.2.4.1 Mélanger l'ensemble du contenu de la conserve ou une aliquote représentative afin d'obtenir une suspension homogène.
  
  
• 6.2.4.2 A 25 grammes de suspension ajouter 25 ml de tampon d'extraction reconstitué.
  
  
• 6.2.4.3 Procéder ensuite comme décrit dans le protocole général d'extraction.

6.2.5 Produits de la mer, produits carnés crus et produits de charcuterie:

• 6.2.5.1 Mélanger 25 grammes d'aliment dans 25 ml d'eau distillée à haute vitesse pendant 3 minutes pour obtenir une suspension homogène. Dans le cas où cette suspension serait trop compacte ajouter 25 ml d'eau distillée supplémentaire. Mélanger de nouveau.
  
  
• 6.2.5.2 Récupérer la totalité de l'extrait.
  
  
• 6.2.5.3 Vérifier le pH de la suspension et ajuster à pH à 4,0 avec une solution HCl 5 N.
  
  
• 6.2.5.4 Laisser reposer pendant 15 à 30 min à 18-25°C.
  
  
• 6.2.5.5 Centrifuger l'échantillon mélangé dans la solution d'extraction pendant 15 min. à 3000-5000 x g à 18-25°C.
  
  
• 6.2.5.6 Récupérer le surnageant et le filtrer sur coton hydrophile humidifié placé à l'intérieur d'une seringue en utilisant le piston de la seringue.
  
  
• 6.2.5.7 Vérifier le pH du filtrat et ajuster entre pH 7.5 et 8.0 si nécessaire, à l'aide d'une solution de NaOH 1N.
  
  
• 6.2.5.8 Si un précipité est obtenu re-centrifuger une aliquote de l'extrait comme décrit précédemment.
  
  
• 6.2.5.9 Pipeter 500 µl de filtrat et les transférer dans puits d'échantillon d'une cartouche VIDAS SET2 avant de mettre en marche l'appareil.

6.2.6 Produits laitiers :

• 6.2.6.1 Procédures sans concentration :
  
  
  • 6.2.6.1.1 A 25 grammes d'aliments ajouter 40 ml d'eau distillée pré-incubée à 38 + 2°C.
    
    
  • 6.2.6.1.2 Mélanger à haute vitesse pendant 3 minutes afin d'obtenir une suspension homogène.
    
    
  • 6.2.6.1.3 Laisser en contact pendant 30 min. à 18-25°C.
    
    
  • 6.2.6.1.4 Vérifier le pH de la suspension et ajuster entre pH 3,5 et 4,0 avec une solution de HCl 5N.
    
    
  • 6.2.6.1.5 Centrifuger la suspension pendant 15 min à 3000-5000 x g à 18-25°C.
    
    
  • 6.2.6.1.6 Récupérer le surnageant et ajuster son pH entre 7.5 et 8.0 à l'aide d'une solution de NaOH 1N.
    
    
  • 6.2.6.1.7 Centrifuger l'extrait à 3000-5000 x g pendant 15 min. à 18-25°C et filtrer si nécessaire.
    
    
  • 6.2.6.1.8 Pipeter 500 µl de filtrat et les transférer dans un puits d'échantillon d'une cartouche VIDAS SET2 avant de mettre en marche l'appareil.

• 6.2.6.2 Pour les produits liquides (exemple: lait)
  
  
  • 6.2.6.2.1 Prélever 25 ml (ou 25 gr) de solution et ajuster le pH entre 3,5 et 4,0 avec une solution d'HCl 5N.
    
    
  • 6.2.6.2.2 Poursuivre la procédure comme indiqué précédemment.
    
    
• 6.2.6.3 Concentration par l'acide trichloracétique (TCA):

Note:
Cette procédure est recommandée pour augmenter les concentrations des toxines pour les produits laitiers et supprimer les rares interférences éprouvées avec certains fromages au lait cru (exemple: Roquefort.)

Mise en garde:
Ne pas utiliser de cuillères métalliques ou des utensiles avec de l'acide trichloracétique, référez-vous à la fiche signalétique.

• • 6.2.6.3.1 Le mode de préparation de la solution d'acide trichloracétique est décrit dans le paragraphe "Préparation de la solution d'acide trichloracétique à 90 %" (Voir Section 6.1.2).
    
    
  • 6.2.6.3.2 Suivre le protocole décrit pour les produits laitiers jusqu'à la fin de la 1^ère centrifugation.
    
    
  • 6.2.6.3.3 Récupérer le surnageant et mesurer son volume V dans un tube à centrifugation.
    
    
  • 6.2.6.3.4 Ajouter rapidement un volume (Y) d'une solution d'acide trichloracétique (à 90% dans de l'eau), correspondant à 5% du volume de surnageant récupéré (Y = V x 5/100).
    
    
  • 6.2.6.3.5 Homogénéiser et laisser la précipitation des protéines se réaliser pendant 30 min à 18- 25°C.
    
    
  • 6.2.6.3.6 Centrifuger la suspension à 3000-5000 x g pendant 30 min. à 18-25°C.
    
    
  • 6.2.6.3.7 Eliminer délicatement l'intégralité du surnageant
    
    
  • 6.2.6.3.8 Dissoudre le culot protéique dans un volume de tampon TRIS 0,3M pH 8,0 correspondant à 1/10 du volume de surnageant (V) traité par le TCA.
    
    
  • 6.2.6.3.9 Ajuster si nécessaire le pH de la solution entre 7.5 et 8.0 avec une solution de NaOH 4N.
    
    
  • 6.2.6.3.10 À ce pH la solution laiteuse se clarifie pour devenir être limpide. Si des particules en suspension sont observées re-centrifuger la solution pendant 15 min à 3000-5000 x g à 18- 25°C.
    
    
  • 6.2.6.3.11 Pipeter 500 µl de solution et les transférer dans un puits d'échantillon d'une cartouche VIDAS SET2 avant de mettre en marche l'appareil.

6.3 Conservation des extraits

L'essai VIDAS SET2 doit être réalisé immédiatement après l'extraction. Pour les produits autres que les produits laitiers une conservation des extraits pendant 7 jours à -25 + 6 °C peut être envisagée. Pour certaines matrices spécifiques, il est recommandé de valider la stabilité des extraits entreposés à -25 + 6°C pendant 7 jours.

6.4 Analyse VIDAS

6.4.1 Saisie des données de lot et étalonnage

Se référer à la fiche technique VIDAS SET 2 pour plus d'informations.

6.4.2 Réalisation de l'essai

• 6.4.2.1 Sortir uniquement les réactifs nécessaires, les laisser 30 minutes à température ambiante avant utilisation.
  
  
• 6.4.2.2 Utiliser une cartouche "SET2" et un cône "SET2" pour chaque échantillon, contrôle ou calibrateur à éprouver. Vérifier que le sachet de cônes a bien été refermé après chaque utilisation.
  
  
• 6.4.2.3 Taper ou sélectionner "SET2" sur l'instrument pour entrer le code d'essai. Le standard identifié obligatoirement par "S1", doit être utilisé en double. Si le contrôle positif doit être testé, il sera identifié par "C1". Si le contrôle négatif doit être testé, il sera identifié par "C2". Note : Si un essai correspond à un standard, taper "S" ("S" puis "1" sur mini VIDAS) pour son identification.
  
  
• 6.4.2.4 Bien homogénéiser le standard, les contrôles et les échantillons à tester, avant leur utilisation, pour une meilleure reproductibilité des résultats. Pipeter avec précision 500 µl de standard lorsqu'une calibration est effectuée, afin d'assurer la qualité de la mesure.
  
  
• 6.4.2.5 Distribuer, dans le premier puits de la cartouche, 500 µl 50 µl d'échantillon, ou de contrôle (Note: les échantillons et les contrôles doivent être éprouvés en simple).
  
  
• 6.4.2.6 Placer dans l'instrument les cônes et les cartouches. Bien vérifier la concordance des (couleurs et lettres) entre le cône et la cartouche.
  
  
• 6.4.2.7 Démarrer l'analyse tel que décrit dans le manuel d'utilisation. Toutes les étapes sont alors gérées automatiquement par l'instrument. Les résultats sont obtenus en 80 min. environ.
  
  
• 6.4.2.8 À la fin de l'analyse, retirer les cônes et les cartouches de l'instrument.
  
  
• 6.4.2.9 Eliminer les cônes et cartouches utilisés dans un récipient approprié.

6.5 Lecture des résultats

6.5.1 Dès l'essai terminé, les résultats sont analysés automatiquement par le système informatique.

6.5.2 Le calcul de la RFV (Relative Fluorescence Value) est calculé en soustrayant la valeur du bruit de fond de la valeur finale. Il apparaît sur la feuille de résultats.

6.6 Interprétation des résultats

6.6.1 La RFV obtenue pour chaque échantillon est interprétée par l'instrument VIDAS de la manière suivante :

Valeur de l'essai = RFV échantillon/RFV standard

Valeur de l'essai	Interprétation
< 0,13	Négatif
= 0,13	Positif

6.6.2 Un résultat avec une valeur d'essai inférieure à la valeur seuil indique un échantillon ne contenant pas d'entérotoxines ou contenant une concentration d'entérotoxines inférieure à la limite de détection.

6.6.3 Un résultat avec une valeur d'essai supérieure ou égale à la valeur seuil indique un échantillon contaminé.

7. Notes

7.1 Contrôle de qualité

Un contrôle positif et un contrôle négatif sont inclus dans chaque trousse VIDAS SET2. Ces contrôles doivent être utilisés immédiatement à l'ouverture de chaque nouvelle trousse afin de vérifier l'absence d'altération des réactifs. Les contrôles doivent accompagner chaque étalonnage.

Pour que l'instrument puisse vérifier la valeur des contrôles, il faut obligatoirement les identifier par C1 et C2.

La valeur attendue pour le contrôle positif est indiquée sur la carte MLE (Master Lot Entry) Si la valeur du contrôle positif s'écarte des valeurs attendues, les résultats ne peuvent pas être validés.

Il est de la responsabilité de l'utilisateur de s'assurer que le contrôle de qualité est mis en oeuvre conformément à la législation locale en vigueur.

7.2 Limites de l'essai

Les performances de ce système n'ont pas été établies pour une utilisation autre que celle décrite dans la documentation, notice technique ou manuel d'utilisation. Consulter l'encart accompagnant la trousse pour obtenir des informations supplémentaires sur les limites de détection.

Tout changement ou modification dans la procédure pourra avoir une incidence sur les résultats.

De rares interférences ont été observées avec des fromages au lait cru de type pâtes persillées (ex. Roquefort). La méthode de concentration par l'acide trichloracétique permet de s'affranchir de ces interférences.

8. References bibliographiques

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8.3 Breckinridge, J.C. and M.S. Bergdoll. 1971. Outbreak of food-borne gastroenteritis due to a coagulase-negative enterotoxin-producing Staphylococcus. N. Engl. J. Med. 284: 541-543.

8.4 Genigeorgis, C. 1989. Present state of knowledge on staphylococcal intoxication. Int. J. Food Microbiol. 9:327-360.

8.5 Hirooka, E.Y., E.E. Muller, J.C. Freitas, E. Vicente, Y. Yoshimoto, and M.S. Bergdoll. 1988. Enterotoxigenicity of Staphylococcus intermedius of canine origin. Int. J. Food Microbiol. 7:185-191.

8.6 Jechorek R.P., and R.L. Johnson. 2008. Evaluation of the VIDAS® Staph Enterotoxin II (SET 2) Immunoassay Method for the Detection of Staphylococcal Enterotoxins in Selected Foods: Collaborative Study. J. AOAC Int. 91:164-173.

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