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Aliments et nutrition

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Dénombrement de Listeria monocytogenes dans les aliments

Procédure de laboratoire MFLP-74
février 2011

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(Version PDF - 69 Ko)

Direction Générale des Produits de Santé et des Aliments

Ottawa

Dénombrement de Listeria monocytogenes dans les aliments

Franco Pagotto¹, Yvon-Louis Trottier¹, Jacqueline Upham² et Irène Iugovaz¹

¹Division de la recherche, Bureau de dangers microbiens, Direction des aliments, Santé Canada, Ottawa (Ontario), DGPSA, Repère postal 2204E, K1A 0K9

²Agence Canadienne d'Inspection des Aliments, Laboratoire de microbiologie, Laboratoire de Dartmouth, 1992 Agency drive, Dartmouth, NS, B3B 1Y9.

Courriel : micro_methods_committee@hc-sc.gc.ca

1. Application

Cette méthode est applicable au dénombrement des Listeria monocytogenes viables afin de déterminer s'il y a conformité aux articles 4 et 7 de la Loi des Aliments et Drogues. Cette méthode remplace la méthode MFLP-74 datée d'aoûts 2010

2. Principe

Cette méthode d'ensemencement direct permet de déterminer quantitativement le nombre de L. monocytogenes viables présents dans un produit. Ainsi, une portion du produit est mélangée à un diluant approprié puis étalée sur la surface d'au moins deux géloses sélectives, lesquelles sont alors incubées pendant une période déterminée à une température donnée. On présume que dans ces conditions spécifiques, chaque cellule viable de L. monocytogenes se multipliera pour former une colonie visible qui peut être identifiée. Le choix des milieux sélectifs est fondé sur les résultats de travaux réalisés par d'autres chercheurs (7.3, 7.4, 7.5).

3. Définitions des termes

Voir l'Annexe A du volume 3.

4. Prélèvement des échantillons

Voir l'Annexe B du volume 3.

5. Matériel et équipements spéciaux

Voir la section du « Matériel et produits spéciaux » de la méthode MFHPB-30.

Voir l'annexe G pour la composition des milieux individuels

Autres produits nécessaires :

1) Eau peptonée, 0.1 % (p/v)

2) Géloses d'ensemencement :

Les milieux sélectifs suivant comprennent :

gélose d'oxford OXA (gélose obligatoire)

Une des géloses suivantes doit être incluse avec OXA :

- gélose pour Listeria selon Ottaviani & Agosti
- gélose A.L.
- gélose BBL Chromagar Listeria
- gélose Brillance Listeria (Connue auparavant sous le nom de gélose OCLA)
- Milieu au chlorure de lithium, au phényléthanol et au moxalactame (LPM)
- gélose d'Oxford modifiée (MOX)
- gélose PALCAM (PAL)
- gélose Rapid L'Mono

6. Marche à suivre

On peut connaître la distribution des Listeria spp. en analysant chaque unité d'analyse séparément.

6.1 Manipulation et dilution des échantillons

6.1.1 Avant l'analyse au laboratoire, sauf dans le cas d'aliments stables à la température de la pièce, conserver les unités d'échantillonnage réfrigérées ou congelées selon la nature du produit. Faire dégeler les échantillons congelés dans un réfrigérateur, ou pendant une période ainsi qu'à une température qui empêchent la croissance ou la mort des micro-organismes.

6.1.2 Analyser les unités d'échantillonnage le plus tôt possible après leur arrivée au laboratoire.

6.1.3 Pour s'assurer que l'unité d'analyse est représentative, agiter les liquides ou les substances fluides jusqu'à ce qu'elles soient homogènes. Si l'unité d'échantillonnage est un solide, constituer l'unité d'analyse en prélevant des portions à plusieurs endroits de l'unité d'échantillonnage. L'unité d'analyse recommandée est de 10 grammes ou 10 ml.

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6.2 Méthode par ensemencement direct

6.2.1 Préparer une dilution de 1:5, dans de l'eau peptonée à 0,1 % (p/v), dans une jarre de mélangeur ou un sac à stomacher. Bien mélanger au mélangeur ou au stomacher pour deux minutes afin d'obtenir un mélange homogène. Une dilution de 1:10 peut-être utilisée pour les aliments qui requièrent une dilution supérieure dans le but de permettre un meilleur étalement du mélange aliment/diluant sur les géloses sélectives. Ceci peut nécessiter l'ensemencement d'un aliquot supplémentaire sur des géloses additionnelles.

Deux types de géloses sont utilisées pour l'énumération de L. monocytogenes de la façon suivante : prélever immédiatement 1 ml du mélange en prélevant trois portions de 0,333 ml de l'aliment dilué et l'étaler sur la surface de trois pétris de chaque gélose sélective (p. ex.,un total de deux ml est étalé sur deux types de géloses). Les milieux sélectifs comprennent la gélose OXA ainsi que l'un des milieux approuvés énumérés à la section 5.

6.2.2 Incuber les géloses LPM à 30°C et toutes les géloses sélectives à 35°C pendant 48 heures à moins que la duré et température d'incubation ne soit précisée par le manufacturier. Examiner toutes les géloses à 24 heures pour détecter la présence de colonies typiques et à 48 h si applicable au milieu utilisé (sections 6.3.1 à 6.3.8).

NOTE :

S'assurer que les géloses soient soigneusement séchées avant leur utilisation afin d'éviter l'étalement exagéré des colonies. Après l'étalement en surface de l'aliquot, s'assurer que les géloses soient sèches avant de les inverser et de les déposer dans l'incubateur.
On peut utiliser des géloses chromogéniques et d'autres nouvelles géloses d'isolement, mais seulement de concert avec le milieu obligatoire et l'un des milieu recommandé à la Section 5. Trois pétris de chaque milieu chromogénique non validé doivent être utilisés de la même façon que les géloses énumérées à la Section 5.
Pour permettre une certaine flexibilité au niveau des périodes d'incubation, les directives suivantes peuvent être utilisées : période d'incubation de 24h ± 2 h ou 48h ± 4 h.

6.3 Identification présumée

6.3.1 Géloses OXA et MOX - Après 24 heures, L. monocytogenes forme des colonies noires d'un diamètre de 1 mm entourées d'un halo noir. Après 48 heures, les colonies ont de 2 à 3 mm de diamètre et sont noires, avec un halo noir et un centre affaissé. Les colonies peuvent aussi apparaître brun-noir ou vert-noir. D'autres espèces de Listeria présentent un aspect semblable. Si l'on examine les boîtes moins de 24 heures après le début de l'incubation, on peut parfois déceler des colonies de Listeria spp. mais sans le noircissement caractéristique. Certaines souches de Listeria, autres que L. monocytogenes, sont inhibées par ce milieu lorsqu'il est incubé à 35°C.

6.3.2 Gélose LPM - Pour repérer les colonies suspectes sur les géloses LPM, examiner les boîtes à l'aide d'un faisceau de lumière blanche assez puissant pour bien éclairer la gélose, orienté à un angle de 45° avec le fond de la boîte (7.6). Si la transillumination est optimale, les colonies de Listeria les plus isolées et les plus grosses (âgées de 48 heures) apparaissent comme des amas blanchâtres de verre pilé présentant souvent des structures internes en mosaïque et, parfois, des reflets iridescents bleu-gris qui ont tendance à scintiller. Les colonies peuvent aussi apparaître lisses et bordées de bleu. Lorsque la croissance est presque confluente, on peut observer un reflet bleu-gris iridescent et homogène.

6.3.3 Gélose PAL - Les colonies de L. monocytogenes mesurent environ 2 mm de diamètre et ont une coloration gris-vert. Elles présentent un centre noir et affaissé et un halo noir sur fond rouge cerise. Certaines souches d'Enterococcus et de Staphylococcus forment des colonies grises entourées d'un halo brun-vert, ou des colonies jaunes entourées d'un halo jaune.

6.3.4 Gélose Listeria selon Otaviani & Agosti - Les colonies de Listeria sont bleu-vert, L. monocytogenes et L. ivanovii forment des colonies bleu-vert entourées d'un halo blanc opaque. Après 24 heures, les autres espèces Listeria forment des colonies bleu-vert SANS halo. Consulter la notice d'utilisation du manufacturier pour une description plus détaillée.

6.3.5 Gélose A.L. - Toutes les espèces de Listeria forment des colonies bleues à bleu-vert, les colonies de L. monocytogenes et de L. ivanovii forment des halos opaques autour des colonies après 24 et 48 heures respectivement.

6.3.6 BBL CHROMagar - L. monocytogenes et L. ivanovii forment des colonies bleu-vert entourées d'un halo blanc opaque. Les autres espèces de Listeria forment des colonies bleu-vert sans halo.

6.3.7 Gélose Brillance Listeria (autrefois gélose OCLA) - L. monocytogenes et L. ivanovii forment des colonies bleues entourées d'un halo opaque, alors que les autres espèces de Listeria forment des colonies bleuessansla présence d'un halo après 24 h.

6.3.8 RAPID L. Mono - L. monocytogenes forme des colonies bleues sans halo jaune alors que L. ivanovii forme des colonies bleu-verdâtre avec un halo jaune. Toutes les autres espèces de Listeria sont d'une couleur jaune à blanche.

6.4 Dénombrement et confirmation des colonies obtenues par ensemencement direct

6.4.1 Rechercher les colonies typiques dans chaque ensemble de géloses en triple de chacun des deux milieux sélectifs utilisés. Puisqu'il est attendu que les Listeriae seront présents en faible nombre, chaque colonie doit être confirmée avant de rapporter le résultat, jusqu'à 15 colonies par type de gélose.

6.4.2 Confirmer qu'il s'agit de L. monocytogenes en appliquant la marche à suivre décrite dans la méthode MFHPB-30.

NOTE : Au minimum, toutes les colonies jusqu'à 15 par type de gélose doivent être confirmées avant de reporter le résultat tel que décrit à la section 6.5

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6.5 Interprétation

6.5.1 Consigner séparément les résultats de chacun des deux types de milieu sélectif. Calculer les Unités Formant Colonies (UFC) par g (ou ml) en utilisant l'équation suivante :

Nombre de UFC / Volume ensemencé (ml) × facteur de dilution total

Exemple :

Une dilution de 1:5 d'une matrice alimentaire est effectuée. Un (1) ml de la suspension est étalé sur trois géloses OXA et 1 ml sur trois géloses PAL. Après incubation, la somme totale pour chaque gélose OXA est de 5 colonies et la somme totale des géloses PAL est de 15 colonies.

Utilisant l'équation ci-dessus :

5 colonies / 1(volume inoculé, ml) × 0.2 (facteur de dilution)

= 25 UFC/g

De même pour les géloses PAL

15 colonies / 1(volume inoculé, ml) × 0.2 (facteur de dilution)

= 75 UFC/g

Le compte final suivant est rapporté = 75 UFC/g
(Notez que seulement le compte le plus élevé est rapporté)

NOTE : Lorsque possible, le compte exact devrait être rapporté. D'autres options, considérations ou suggestions utiles sont présentées ci-dessous

S'il n'y a aucune colonie à la dilution 1:5, rapporter comme étant < 5 UFC/g de L. monocytogenes. Si aucune colonie n'est récupérée à une dilution de 1:10, rapporter comme étant <10 UFC/g de L. monocytogenes.
Si plus de 200 colonies typiques apparaissent sur chaque type de gélose, l'échantillon alimentaire peut être analysé à nouveau en utilisant une dilution supérieure (c.-à-d., 1:50 ou 1:100) afin de permettre un dénombrement plus précis. Cette situation peut survenir lors d'une éclosion ou lors d'une contamination massive d'une denrée alimentaire.
Toujours utiliser le type de gélose avec le plus grand nombre de colonies récupérées pour calculer le compte final en UFC/g ou UFC/ml.
Dans l'exemple de calcul précédent, s'il y a plus de 20 colonies présumées par type de gélose, 5 colonies typiques par pétri (jusqu'a un total de 15 colonies) devraient être confirmées comme étant représentatives de la population des colonies présumées. Lorsque confirmées, un ratio peut être appliqué sur toutes les colonies comptées. Par exemple, si 75 colonies présumées sont comptées et que les 15 sélectionnées sont confirmées comme étant L. monocytogenes, alors le compte utilisé est de 75 L. monocytogenes, pour un compte final rapporté de 375 UFC/ml; de la même façon, si seulement 3 des 15 sont confirmées comme étant L. monocytogenes, le compte sera de 75 × 3/15 = 15 L. monocytogenes, pour un compte final rapporté de 75 UFC/ml.

7. Références

7.1 Pagotto, F., E. Daley, Farber, J.M. 2002. Dénombrement de listeria monocytogenes dans les aliments (MFLP-74). Compendium de méthodes, volume 3. Disponible sur http://www.hc-sc.gc.ca/fn-an/res-rech/analy-meth/microbio/volume3/mflp74-fra.php

7.2 Supplement à la methode MFLP-74. 2004. Compendium de méthodes, volume 3. Disponible sur : http://www.hc-sc.gc.ca/fn-an/res-rech/analy-meth/microbio/volume3/mflp74-sup-fra.php

7.3 Poysky, F.T., R.N. Paranjpye, L.C. Lashbrook, M.E. Peterson, G.A. Pelroy et M.W. Eklund. 1993. Selective and differential medium for isolation of Listeria monocytogenes from foods. J. Food Prot. 56:326-329, 332.

7.4 Warburton, D.W., J.M. Farber, A. Armstrong, R. Caldeira, T. Hunt, S. Messier, R. Plante, N.P. Tiwari et J. Vinet.1991. A comparative study of the "FDA" and "USDA" methods for the detection of Listeria monocytogenes in foods. Int. J. Food Microbiol. 13:105-118.

7.5 Warburton, D.W., J.M. Farber, A. Armstrong, R. Caldeira, N.P. Tiwari, T. Babiuk, P. LaCasse et S. Read. 1991. A Canadian comparative study of modified versions of the "FDA" and "USDA" methods for the detection of Listeria monocytogenes. J. Food Prot. 54:669-676.

7.6 American Public Health Association (APHA). 2001. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. Quatrième édition. Chapitre 35. F.P. Downes et K. Ito (éditeurs), American Public Health Association, Washington, D.C.

7.7 Pagotto, F., Hébert, K., J. Farber. 2011. Isolement de Listeria monocytogenes et autres Listeria spp. dans les aliments et les échantillons environnementaux. Volume 2. Compendium des Méthodes. http://www.hc-sc.gc.ca/food-aliment

Figure 1. Schéma de la procédure d'énumération

Unité d'analyse (x gramme ou x mL)
+
Diluant pour la préparation de la suspension 1:5

Mélanger ou broyer au stomacher pour 2 minutes

Ensemencer une gélose OXA et un second type de gélose par étalement en surface d'un mL sur 3 géloses de chaque type

Incuber à la temperature appropriée pour 48h; vérifier les pétris après 24h

Sélectionner les colonies démontrant une morphologie typique

Confirmer les colonies présumées

Interprétation et rapport des résultats

Fin Du Document

¹ Dans le contexte, le terme BPF est utilisé de façon générique et inclut toutes les conditions et mesures de contrôle nécessaires pour que les transformateurs puissent assurer la sécurité et la qualité des aliments pendant leur production.

² Aux fins du présent document, ces échantillons englobent les surfaces qui entrent en contact avec les aliments (SCA) et les surfaces qui n'entrent pas en contact avec les aliments (SNCA).

Pour ce qui est des traitements de post-létalité « non nouveaux », il est fortement recommandé que le BDM, Direction des Aliment, DGPSA de Santé Canada évalue l'innocuité et l'efficacité microbiologique de ces techniques nouvelles ou améliorées de transformation et manipulation des aliments proposées par l'industrie alimentaire (p. ex., pasteurisation à la vapeur, traitement à l'eau chaude, chauffage radiant au four, chauffage infrarouge).