Détection d'E. coli O157:H7 dans le bœuf haché cru et les découpes de bœuf crues par la méthode en temps réel du système Qualicon BAX^® de DuPont

Procédure de laboratoire MFLP-76
Avril 2011

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Direction générale des produits de santé et des aliments
Ottawa

Détection d'E. coli O157:H7 dans le bœuf haché cru et les découpes de bœuf crues par la méthode en temps réel du système Qualicon BAX^® de DuPont

Comité des méthodes microbiologiques
Division de l'évaluation microbiologique
Bureau des dangers microbiens, Direction des aliments
Direction générale des produits de santé et des aliments, Santé Canada
Localisateur postal : 2204E
Ottawa (Ontario) K1A 0K9

Courriel : micro_methods_committee@hc-sc.gc.ca

1. Application

La présente méthode s'applique à la détection rapide d'Escherichia coli O157:H7 afin d'en déterminer la conformité avec les exigences des articles 4 et 7 de la Loi sur les aliments et drogues. Lorsqu'une action de conformité envers le produit est anticipée, et où il est indiqué, la méthode HPFB MFLP-80 (8.1) ou l'équivalent est utilisé pour confirmer les échantillons présomptifs positifs obtenus à partir de cette méthode.

Note : Même si cette méthode est approuvée seulement pour certains produits alimentaires tels qu'énumérés ci-dessus, on peut assumer qu'elle peut être utilisée pour d'autres produits alimentaires. Pour s'assurer que la méthode convient pour l'utilisation visée avec d'autres produits alimentaires, il est impératif qu'elle soit correctement validée avec ces autres produits alimentaires selon les lignes directrices du Compendium des méthodes analytiques. Nous demandons de transmettre ces données de validation au Comité des méthodes de microbiologie afin que nous puissions réviser la portée d'application de la méthode à la lumière de ces nouvelles données à condition que celles-ci répondent aux critères d'acceptabilité du CMM (voir Élaboration de méthodes dans le volume 1 du Compendium des méthodes.)

2. Description

Le système BAX^® est un instrument rapide pour le dépistage présomptif d'E. coli O157:H7 dans les échantillons de bœuf haché cru et de découpes de bœuf crues. L'épreuve en temps réel du système BAX^® pour E. coli O157:H7 détecte le sérotype spécifique pour l'organisme dans des échantillons de 65 g de bœuf haché cru en 9 heures et des échantillons de découpes de bœuf crues de 375 g en 10 heures à l'aide du milieu du système BAX^®.

Le système BAX^® pour E. coli O157:H7 est un instrument pratique de dépistage de type « positif/négatif » qui utilise la technologie de la réaction en chaîne de la polymérase (PCR) et de la sonde fluorescente Scorpion™ pour produire des résultats fiables dans un délai d'environ 10,5 h suivant l'échantillonnage. Après la période d'enrichissement, la procédure demande environ 1,5 h et la préparation de l'échantillon requiert moins d'une heure. Le système BAX^® est conçu pour être utilisé par un personnel de laboratoire qualifié qui observe les procédures normalisées de microbiologie.

3. Principe

Le PCR représente une méthode qui offre rapidement des millions de copies d'un fragment précis d'ADN. Dans une application typique, on combine l'échantillon d'ADN à une polymérase, des nucléotides et des amorces spécifiques pour une séquence donnée de nucléotides. Ce mélange est alors soumis à une série de cycles chronométrés de chauffage et de refroidissement. Le chauffage dénature ou sépare l'ADN en brins distincts. Au fur et à mesure que le mélange refroidit, les amorces reconnaissent la séquence cible d'ADN et s'y fixent par annelage. L'ADN polymérase utilise ensuite les nucléotides pour étendre les amorces, ce qui a pour effet de créer deux copies du fragment d'ADN cible. Des cycles répétés de dénaturation, d'hybridation et d'élongation produisent des augmentations exponentielles du nombre de fragments d'ADN cibles en quelques heures à peine. Aucune amplification détectable n'est produite, si la séquence cible n'est pas présente.

Le système BAX^® pour E. coli O157:H7 cible un fragment d'ADN bactérien spécifique pour le sérotype d'E. coli O157:H7. Ce fragment d'ADN est stable, non affecté par l'environnement de croissance et unique pour E. coli O157:H7. La technologie de la réaction en chaîne de la polymérase (PCR) permet au système BAX^® de produire une amplification rapide de l'ADN spécifique et des résultats présomptifs dans les quatre heures suivant l'enrichissement. Le système BAX^® fournit les amorces, la polymérase, les nucléotides et le témoin positif dans une seule tablette d'échantillon pré-emballée dans des tubes PCR. De plus, la détection automatique par fluorescence permet les tests en tubes fermés, éliminant la possibilité de contamination entraînée avec l'ADN amplifié.

La méthode en temps réel du système BAX^® utilise la détection par fluorescence pour analyser le produit PCR. Une sonde PCR pour chaque cible (deux cibles spécifiques pour E. coli O157:H7 et un témoin interne) contient un fluorochrome (trois différents colorants, un pour chaque cible) à titre de constituant de la sonde, en plus d'un extincteur de luminescence (la sonde Scorpion^™ est une combinaison monomoléculaire d'une amorce d'ADN, d'un colorant fluorescent et d'un extincteur de luminescence). À la suite de leur incorporation dans un produit PCR, le colorant fluorescent et l'extincteur de luminescence sont spatialement séparés, ce qui cause l'accentuation du signal émis. Le système BAX^® mesure l'ampleur et les caractéristiques du changement du signal fluorescent. L'algorithme du logiciel du système BAX^® analyse le produit, puis évalue ces données pour déterminer le résultat positif ou négatif affiché (voir plus bas dans le texte).

4. Définition des termes

Voir l'annexe A du volume 3.

5. Prélèvement des échantillons

Voir l'annexe B du volume 3.

6. Matériel et équipement spéciaux

Note : Il est de la responsabilité du superviseur du laboratoire de voir à ce que l'analyse décrite dans cette méthode soit réalisée en accord avec la Norme Internationale intitulée «ISO/IEC 17025:2005 (ou la version plus récente): Prescriptions générales concernant la compétence des laboratoires d'étalonnages et d'essais».

6.1 Trousse d'analyse en temps réel du système BAX^® pour E. coli O157:H7 (n^o de catalogue DuPont Qualicon D14203648; pour effectuer 96 analyses) :

• 6.1.1 2 sachets - tablettes d'échantillon PCR, emballées à raison d'une (1) tablette par tube PRC dans 12 bandelettes de 8 tubes. Les tablettes comprennent les réactifs nécessaires à la réaction du test, ainsi qu'un témoin positif interne (ce qui évite d'avoir à exécuter une réaction CQ distincte). Les tablettes pèsent 7,6 ± 0,1 mg.
• 6.1.2 1 sachet - bouchons optiques, 12 bandelettes de 8 bouchons.
• 6.1.3 2 bouteilles - tampon de lyse, pH de 8,35 ± 0,05 à 25 °C, 12 ml/bouteille. Utiliser pour préparer le réactif de lyse.
• 6.1.4 1 flacon - solution de protéase, 400 mlL/flacon. Utiliser pour préparer le réactif de lyse.

Note : Si l'analyste utilise toute variation des milieux énumérés ci-dessous (produit disponible sur le marché ou fabriqué à partir d'ingrédients), il incombe à l'analyste ou au superviseur du laboratoire d'en assurer l'équivalence.

6.2 Bouillon d'enrichissement - milieu MP du système BAX^® (no de catalogue DuPont Qualicon D12404925, D12745725 ou D12614061).

6.3 Équipements et fournitures (fournis avec la trousse de démarrage du système BAX^®) :

• 6.3.1 Cycleur/détecteur Q7 du système BAX^®.
• 6.3.2 Poste de travail informatique avec le système d'exploitation Microsoft Windows, le logiciel du système BAX^® et une imprimante.
• 6.3.3 Blocs de chauffage avec dispositif d'ancrage à thermomètres pour les tubes de lyse.
• 6.3.4 Outils de capsulage/décapsulage.
• 6.3.5 Pipettes variées pour les transferts des échantillons.
• 6.3.6 Blocs de refroidissement avec dispositif d'ancrage pour les tubes de lyse et les tubes PCR.
• 6.3.7 Supports pour tubes PCR.
• 6.3.8 Tubes de lyse avec bouchons et supports.
• 6.3.9 Embouts de pipette.
• 6.3.10 Gants de nitrile sans poudre.

6.4 Guide d'utilisation Q7 du Système BAX^® (version 2.8).

6.5 Incubateurs capables de préchauffer le milieu à 45 ± 0.5 °C (découpes de bœuf) et à conserver les enrichissements à 42 ± 0.5 °C (bœuf haché et découpes de bœuf).

Note : Il incombe à chaque laboratoire de s'assurer que les incubateurs ou les bains-marie sont maintenus à la température recommandée. Lorsqu'on recommande des températures de 42 ou 45_°C, il est impératif de maintenir les incubateurs ou les bains-marie à ± 0,5_°C parce que des températures plus élevées peuvent être létales pour le micro-organisme qu'on cherche à isoler.

6.6 Stomacher, mélangeur ou équivalent.

7. Marche à suivre

7.1 Manipulation des unités d'échantillonnage

• 7.1.1 Bœuf haché - Préparer le volume nécessaire de milieu du système BAX^® selon les instructions affichées sur l'étiquette du contenant. Ajouter 65 g de bœuf haché cru dans un bouillon préchauffé (42 °C) à une dilution 1:10. Incuber à 42 °C ± 0,5_°C durant 9 à 24 heures.
• 7.1.2 Découpe de bœuf - Préparer le volume nécessaire de milieu du système BAX^® selon les instructions affichées sur l'étiquette du contenant. Ajouter 375 g de découpe de bœuf dans un bouillon préchauffé (45 °C) à une dilution 1:5. Incuber à 42 °C ± 0,5_°C durant 10 à 24 heures.

7.2 Préparation pour l'analyse

• 7.2.1 Mettre les blocs chauffants en fonction et vérifier que les températures sont réglées à 37 °C et 95 °C.
• 7.2.2 Initialiser le cycleur/détecteur (voir les instructions du Guide d'utilisation Q7 du Système BAX^®).

7.3 Lyse des échantillons

• 7.3.1 Préparer les tubes de lyse et transférer les échantillons.
• 7.3.2 Placer dans le support le nombre requis de tubes de lyse (un pour chaque échantillon, et un pour le « blanc »).
• 7.3.3 Préparer le réactif de lyse en pipetant 150 µl de protéase dans une bouteille de tampon de lyse.
• 7.3.4 Ajouter 200 µl de réactif de lyse dans chaque tube de lyse.
• 7.3.5 Transférer 20 µl d'échantillon enrichi dans le tube de lyse correspondant.
• 7.3.6 Bien fermer les bouchons après avoir effectué tous les transferts.
• 7.3.7 Chauffer les tubes à 37 °C durant 20 minutes, puis à 95 °C durant 10 minutes.
• 7.3.8 Placer les tubes de lyse dans le bloc de refroidissement durant au moins 5 minutes.
• 7.3.9 Préparer les tubes PCR et transférer le lysat.
• 7.3.10 Placer le support de tubes PCR dans le bloc de refroidissement PCR.
• 7.3.11 Placer un tube PCR par échantillon dans le support.
• 7.3.12 Retirer et jeter le couvercle d'une bandelette de tubes à la fois. Utiliser une pipette à canaux multiples pour transférer 30 µl de chaque échantillon lysé dans le tube PCR correspondant. Recouvrir les tubes avec une nouvelle bandelette de bouchon optique et bien refermer.
• 7.3.13 Répéter pour tous les échantillons.
• 7.3.14 Déposer le bloc entier de refroidissement dans le cycleur/détecteur. Les échantillons devraient rester dans le bloc de refroidissement jusqu'à ce que le cycleur/détecteur soit prêt à être chargé, mais durant une période n'excédant pas 30 minutes après l'hydratation de la tablette.

7.4 Amplification de l'ADN

Suivre à l'écran les directives de l'assistant PCR pour charger les échantillons, exécuter le programme, puis retirer les échantillons, tel qu'il est précisé dans le Guide d'utilisation Q7 du Système BAX^®.

7.5 Examen des résultats affichés

7.6 Confirmation des résultats positifs

Tout résultat positif doit être confirmé par méthode de culture (voir la procédure de laboratoire MFLP-80). Préparer les dilutions appropriées à partir des enrichissements. Ensemencer les dilutions sur des plaques de géloses sélectives spécifiques et confirmer à l'aide de techniques biochimiques et/ou sérologiques.

7.7 Interprétation

Notez que même si un résultat positif indique la présence d'E. coli sérotype O157, il n'indique pas nécessairement la présence d'E. coli vérotoxigénique. Alternativement, un résultat négatif,n'indique pas nécessairement l'absence d'E. coli vérotoxigénique du sérotype non-O157.

8. Références

8.1 Warburton, D. and Christensen, D. 2011. Isolation of E. coli O157:H7 or NM in Foods (MFLP-80). In: Volume 3 The Compendium of Analytical Methods.

Tableau 1. Préparation de la dilution initiale

Type de produit alimentaire	Préparation
Bœuf haché cru	À l'aide d'un Stomacher, bien homogénéiser le matériel dans 9 volumes de milieu d'enrichissement à 42 °C. Il est acceptable de mélanger à l'aide d'un plus petit volume de milieu, puis compléter jusqu'à une quantité suffisante pour obtenir le volume final. Enrichir à 42 °C.
Découpe de bœuf	Ajouter quatre volumes de milieu d'enrichissement à 45 °C. Bien mélanger par tourbillonnage ou massage manuel de la découpe dans le milieu. Enrichir à 42 °C.

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