Méthode de détection d'escherichia coli producteurs de vérocytotoxines dans des échantillons d'aliments

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1.3 M^me Shirley Toms
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2. Principe

Ce protocole décrit le dosage sur lignées cellulaires vero (VCA), analyse qui permet de détecter la présence de VTEC dans des échantillons en démontrant les effets de leurs toxines sur des cultures en couches monocellulaires de cellules vero (3.3, 3.4, 3.7). La sensibilité de cette méthode sensible qui comporte l'utilisation de cellules vero fraîchement trypsinisées peut toutefois varier au jour le jour.

Les liquides surnageants clarifiés provenant des cultures sur de bouillon d'enrichissement sont dilués dans une proportion de 1:5 (1/5 à 1/125) sur des plaques à microtitrer et l'on ajoute aux cupules des microplaques un nombre connu de cellules vero. Après avoir laissé incuber pendant deux jours pour permettre la croissance des cellules vero, on examine au microscope les plaques à microtitrer. On considère la mort des cellules vero comme une indication présomptive de la présence de verocytotoxines (VT) dans les liquides surnageants. L'activité cytotoxique des échantillons positifs est classée selon la dilution la plus élevée à laquelle l'effet cytotoxique est évident. On traite ensuite les échantillons positifs pour isoler le VTEC. Les isolats positifs pour le VT sont alors biotypés, sérotypés et génotypés. Cette méthode est fondée sur celle qu'ont utilisée Read et al (3.3) et Clarke et al (3.7).

D'autres micro-organismes peuvent produire des toxines qui n'ont aucun lien avec les VT mais qui sont toxiques pour les cellules vero. Il se peut donc que la cytotoxicité évidente dans certains échantillons (jusqu'à 20 %) analysés ne soit pas attribuable aux VT (3.3, 3.7). Afin d'éviter de traiter inutilement des échantillons faussement positifs, on peut ajouter une étape facultative pour distinguer ces résultats de ceux d'échantillons véritablement positifs pour les VT. Dans les analyses de dépistage, on prépare une dilution supplémentaire de 1/5 de chaque échantillon dans un diluant contenant des anticorps qui neutralisent les deux types antigéniques de verocytotoxines (VT1 et VT2). Lorsqu'on lit les plaques, on compare les deux dilutions 1/5 de chaque échantillon. On considère qu'un échantillon donne un résultat positif quant à la présence de VT si sa cytotoxicité est neutralisée en grande partie ou complètement par des anticorps anti- VT. Ces anticorps n'affectent pas la toxicité attribuable à d'autres toxines.

3. Références:

3.1 Mann, ED. 1995. Procedure for the Detection of Verocytotoxin producing Escherichia coli in raw and cooked meat samples. DANS : Food Safety Procedures Manual, Version 2.1, mars 1996, protocole officiel de la Direction de l'hygiène vétérinaire et de la défense des végétaux.

3.2 Karmali, MA. 1989. Infection by Verocytotoxin-producing Escherichia coli. Clin Microbiol Rev 2:15-38.

3.3 Read SC, Gyles CL, Clarke RC, Lior H et McEwen S. 1990. Prevalence of verocytotoxigenic Escherichia coli in ground beef, pork and chicken in southwestern Ontario. Epidimiol Infect 105:11-20.

3.4 Konowalchuk J, Speirs JI, Stravric S. 1977. Vero response to a cytotoxin of Escherichia coli. Infect Immun 18:775-779.