Détection de E. coli O157 par la méthode d'immuno-essai visuel (IEV) E. coli O157 de Tecra® et par la méthode d'immunocapture E. coli O157 de Tecra®

Procédure de Laboratoire MFLP-91
février 2006

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DIRECTION GÉNÉRALE DE LA PROTECTION DE LA SANTÉ
OTTAWA

Don Warburton
Division de l'évaluation
Bureau de dangers microbiens
Direction des aliments, Santé Canada
Repère postal : 2204A1
Ottawa (Ontario) K1A OL2

Courriel : Don_Warburton@hc-sc.gc.ca

1. Application

La présente méthode s'applique à la détection de E. coli O157 dans les aliments, les ingrédients alimentaires et les échantillons environnementaux, aux fins de détermination de la conformité aux exigences des articles 4 et 7 de la Loi sur les aliments et drogues. Cette version révisée remplace la méthode MFLP-91 datée d'avril 1997.

La méthode d'immuno-essai visuel® (IEV) E. coli O157 de Tecra® est un système de dépistage rapide et spécifique qui sert à repérer la présence, dans les aliments et les échantillons environnementaux, de E. coli O157, y compris le E. coli O157:H7 et d'autres souches O157 entérohémorragiques. Après l'enrichissement de l'échantillon pendant la nuit, les résultats peuvent être obtenus en moins de 2 heures.

Un résultat présumé positif, et plus particulièrement dans les situations de retrait d'un produit du marché, doit être confirmé à l'aide de la procédure de laboratoire MFLP-80 (7.4). Historiquement, la présence de E. coli O157 est particulièrement difficile à confirmer à partir d'une culture d'enrichissement en raison du niveau élevé d'organismes compétitifs en arrière-plan, y compris d'autres sérotypes de E. coli . La méthode d'immunocapture (IC) E. coli O157 de Tecra® est conçue à titre de technique de dépistage rapide et spécifique qui facilite l'isolement de E. coli O157 après avoir obtenu un résultat présumé positif à l'aide de la méthode IEV.

L'institut de recherche de l'Association of Official Analytical Chemists a accordé le statut Performance Tested (AOAC-RI, numéro de licence 001101) aux méthodes IEV et IC E.coli O157 de Tecra®.

2. Principe

La méthode d'immuno-essai visuel E. coli O157 de Tecra® utilise des anticorps à haute affinité pour sa technique de dosage immuno-enzymatique (ELISA) en «sandwich». Ces anticorps, qui recouvrent la surface des cupules de microtitration, capturent tout antigène de E. coli O157 présent dans l'échantillon enrichi. Tout autre matériel présent dans l'échantillon est éliminé au lavage. Un conjugué anticorps-enzyme particulier au E. coli O157 est ajouté pour compléter le « sandwich ». La présence de E. coli O157 est rendue visible lorsque le conjugué convertit le substrat pour produire une couleur verte. Si E. coli O157 est absent, aucune couleur verte ne se développe. Il faut au total 20 heures pour effectuer le test, ce qui comprend l'étape d'enrichissement pendant la nuit.

Si un résultat présumé positif de présence de E. coli O157 est obtenu par la méthode IEV, un échantillon provenant du même bouillon d'enrichissement peut être ajouté à l'éprouvette no 1 du module IC à l'aide de la bandelette incluse dans la trousse. Des anticorps purifiés et très spécifiques enrobés sur la surface de la bandelette capturent sélectivement tout antigène de E. coli O157 présent dans l'échantillon enrichi. À la suite des étapes d'incubation dans l'éprouvette no 1 et de lavage dans l'éprouvette no 2, la bandelette est transférée dans l'éprouvette no 3 qui contient un bouillon d'enrichissement. Durant l'incubation, l'antigène de E. coli O157 est sélectivement capturé sur la bandelette et reproduit à des niveaux élevés. Après l'incubation, l'éprouvette no 3 qui contient la bandelette est mélangée au vortex pour libérer le E. coli O157 capturé sur la bandelette. Les dilutions préparées sont ensuite ensemencées sur des géloses sélectives pour confirmation.

TECRA® est une marque de commerce enregistrée de TECRA International Pty Ltd.,13, Rodborough Rd, Frenchs Forest, NSW 2086, Australia.

3. Définitions

Voir l'annexe A du volume 3.

4. Prélèvement des échantillons

Voir l'annexe B du volume 3.

5. Matériel et équipements spéciaux

5.1 Trousse d'analyse (IEV) :

Tous les réactifs nécessaires à l'immuno-essai visuel E. coli O157 de Tecra® sont fournis en une seule trousse qui contient suffisamment de produits pour effectuer au maximum 94 tests (il y a 96 cupules, mais il faut utiliser les témoins positif et négatif fournis avec la trousse chaque fois qu'on procède à l'essai). La trousse est disponible en Amérique du Nord chez Biotrace International Inc., C.P. 746, Bothell (WA) 98041 (par courrier postal), ou au 21312, 30^th Drive SE, Bothell (WA) 98021 (sur place).  www.biotrace.com - disponible en anglais seulement.

Instructions
Feuille de travail
Support pour plaque
Languette refermable
Cupules de microtitration enrobées d'anticorps
Réactif 1 - concentré de lavage
Réactif 2 - témoin positif
Réactif 3 - diluant pour le témoin
Réactif 4 - conjugué
Réactif 5 - diluant pour le conjugué
Réactif 6 - substrat
Réactif 7 - diluant pour le substrat
Réactif 8 - solution d'arrêt de réaction
Réactif 9 - additif d'échantillon

5.2 Matériel supplémentaire (IEV) :

Incubateur 35 à 37°C
Incubateur 41 à 43°C
Pipettes sérologiques
Flacon pressable en plastique
Pipettes (20 μL, 50 μL et 200 μL)
Film de plastique
Bain-marie (100°C)
Bouteilles ou tubes à bouchon à vis d'un volume d'au moins 5 ml et résistantes à l'ébullition
Mélangeur vortex
Éprouvettes en verre (15 mm x 15 cm)
Mélangeur/stomacher/sacs pour stomacher

5.3 Milieux de culture (IEV)

Les milieux sont disponibles sur le marché et doivent être préparés et stérilisés conformément aux instructions du fabricant. Voir aussi l'annexe G du volume 3 pour la formulation des milieux individuels.

Bouillons d'enrichissement :
Bouillon EC modifié avec novobiocine (mEC + N). Produit no MECMED500 de Tecra®.
Bouillon de soja de tryptone tamponné avec novobiocine (BTSB + N).

5.4 Trousse d'analyse (IEV) :

Tous les réactifs nécessaires à l'épreuve d'immunocapture E. coli O157 de Tecra® sont fournis en une seule trousse qui contient 20 modules d'essai. La trousse est disponible en Amérique du Nord chez Biotrace International Inc., C.P. 746, Bothell (WA) 98041 (par courrier postal), ou au 21312, 30th Drive SE, Bothell (WA) 98021 (sur place).  www.biotrace.com - disponible en anglais seulement.

Instructions
20 bandelettes enrobées d'anticorps
20 modules d'immunocapture (3 éprouvettes par module) contenant :

Réactif 1 - tampon
Réactif 2 - solution de lavage
Réactif 3 - bouillon de tryptone soja

5.5 Matériel supplémentaire (IC) :

Pipettes, 4 ml
Incubateurs, 35 à 37°C et 41à 43°C
Mélangeur vortex

5.6 Milieux de culture (IC)

Les milieux sont disponibles sur le marché et doivent être préparés et stérilisés conformément aux instructions du fabricant. Voir aussi l'annexe G du volume 3 pour la formulation des milieux individuels.

Diluant stérile (4,5 ml) dans des éprouvettes, p. ex. saline ou peptone 0,1 %
Géloses CT-SMAC
Au moins une gélose supplémentaire de la procédure MFLP-80

6. Marche à suivre

6.1 Manipulation des unités d'échantillonnage

6.1.1 Analysez les échantillons aussitôt que possible. Si nécessaire, entreposez les échantillons dans des conditions de temps et de température qui empêchent la croissance ou la mort de la microflore endogène. Si les unités d'échantillonnage ont été mal entreposées en transit, il est préférable de prélever de nouveaux échantillons.

1. Aliments congelés : les unités d'échantillonnage qui ne présentent aucun signe de décongélation au moment de leur réception peuvent être entreposées au congélateur à des températures variant entre -10 ºC et -20 ºC.
2. Aliments secs et stables à température ambiante : entreposez les unités d'échantillonnage à la température ambiante (20 à 25 ºC).
3. Tout autre aliment, y compris ceux qui sont reçus dans des conditions de décongélation partielle : réfrigérer (2 à 8 ºC) les unités d'échantillonnage. Analyser ces échantillons aussitôt que possible, de préférence dans les 24 heures suivant leur réception.

Décongeler les échantillons congelés à la température ambiante en dedans de 60 minutes; si cela est impossible, décongelez les échantillons dans un réfrigérateur (2 à 8 ºC).

6.1.3 Si l'unité d'échantillonnage reçue est inférieure à l'unité analytique recommandée, analyser toute l'unité et enregistrer le poids utilisé.

6.1.4 Le mélange des échantillons doit être limité à la période minimale requise pour produire une suspension homogène. Un mélange excessif peut physiquement endommager l'échantillon et avoir des effets néfastes sur la microflore endogène.

Pour les produits qui ne requièrent pas de mélange, disperser l'unité analytique dans le bouillon de pré-enrichissement approprié.

6.1.5 Utiliser des techniques d'asepsie et du matériel stérile durant toutes les étapes de l'analyse. Durant l'étape de manipulation de produits en poudre, il est crucial de confiner les manipulations pour éviter toute contamination croisée de l'aire de travail.

6.2 Enrichissement

Les échantillons doivent être enrichis selon le protocole d'enrichissement approprié décrit dans le manuel des méthodes d'immuno-essai visuel (IEV) E. coli O157 de Tecra®. La température des bouillons d'enrichissement doit se situer entre 20 et 25°C avant d'y incorporer les échantillons. Pour les échantillons dont le volume d'analyse est supérieur à 225 ml, il faut préchauffer le bouillon avant d'ajouter l'échantillon.

6.3 Analyse

Suite à l'incubation pendant la nuit, les échantillons doivent être détruits par la chaleur et analysés à l'aide de la trousse IEV E. coli O157 de Tecra® et conformément au manuel d'instruction d'immuno-essai visuel E. coli O157 de Tecra®. L'immuno-essai prend environ 2 heures et les réactions peuvent être lues à l'oeil nu ou à l'aide d'un spectrophotomètre.

6.4 Confirmation par culture

Les échantillons qui présentent un résultat positif par immuno-essai visuel E. coli O157 de Tecra® doivent être confirmés à partir du bouillon d'enrichissement à l'aide de la technique IC E. coli O157 de Tecra®, conformément au manuel d'instruction IC. L'immuno-enrichissement dans le module IC dure environ 4 heures; durant cette période, le nombre de cellules de E. coli O157 augmentera par rapport à la flore compétitive. Le bouillon de l'éprouvette n o 3 du module est ensuite ensemencé sur une plaque contenant la gélose CT-SMAC et sur une gélose supplémentaire précisée dans la procédure MFLP-80. Les colonies typiques sont confirmées selon la procédure MFLP-80.

7. Références

7.1 Rapport d'étude en laboratoire indépendant de l'institut de recherche AOAC (AOAC-RI, numéro de licence 001101). Stephen Shaw. 1999. Laboratoire Carling, Ottawa, Agence canadienne d'inspection des aliments, Ottawa, Canada.

7.2 Commission internationale pour la définition des caractéristiques microbiologiques des aliments (ICMSF).1986. Microorganisms in Foods 2. Sampling for microbiological analysis: Principles and Specific applications. Deuxième édition. University of Toronto Press, Toronto (Ontario).

7.3 Feng, P. et S.D. Weagant. US Food and Drug Administration. Bacteriological Analytical Manual Online. 8 e édition, révision A, 1998. Chapitre 4A - Diarrheagenic Escherichia coli. Disponible à l'adresse suivante : http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-4a.html.

7.4 Warburton, D. et D. Christensen. 2006. MFLP-80. Isolement de E. coli O157:H7 ou NM dans les aliments. Volume 3 du Compendium des méthodes. Disponible sur le site Web de Santé Canada (SC) à l'adresse suivante : http://www.hc-sc.gc.ca/fn-an/res-rech/analy-meth/microbio/volume3/index-eng.php