Détection des norovirus de génogroupes I et II au moyen de techniques (conventionnelle et en temps réel) de la transcriptase inverse-amplification en chaîne de la polymérase (ti-acp)

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Procédure de laboratoire OPFLP-10
Mars 2010

Direction générale des produits de santé et des aliments

Ottawa

Alain Houde¹, Danielle Leblanc¹, Elyse Poitras¹, Pierre Ward¹, Julie Brassard¹, Yvon-Louis Trottier², Peter Mueller³ et Carole Simard³

Comité des méthodes microbiologiques
Division de l'évaluation
Bureau des dangers microbiens
Direction des aliments
Repère postal : 2204E
DGPSA, Ottawa, Ontario, K1A 0K9

Courriel : micro.methods.committee@hs-sc.gc.ca

1. Application

La présente méthode s'applique à l'amplification (concentration) et à la détection de l'ARN des norovirus humains (NoV) des génogroupes I (GI) et II (GII) au moyen de techniques (conventionnelle et en temps réel TaqMan®) de la transcriptase inverse-amplification en chaîne de la ploymérase (TI-ACP), à la suite de l'extraction des acides nucléiques des matrices alimentaires, cliniques et prélevées dans l'environnement. La méthode ne permet pas de distinguer entre des virus infectieux et non infectieux.

2. Description

Ce protocole est normalement utilisé pour amplifier et détecter l'ARN des NoV de génogroupes GI et GII dans les huîtres et les oignons verts (veuillez consulter les OPFLP-01 et OPFLP-03).

3. Principe

L'ARN total est extrait d'un échantillon alimentaire, clinique ou prélevé dans l'environnement au moyen d'une procédure appropriée ou d'un échantillon libre de cellules (p. ex. une suspension-mère de NoV préparée à partir d'échantillons de matières fécales humaines) à l'aide de la minitrousse QIAamp® Viral RNA de Qiagen®. L'extrait final d'ARN est utilisé dans la procédure de la TI-ACP conventionnelle et/ou en temps réel qui amplifie un fragment spécifique en fonction du jeu d'amorces utilisées. Les fragments amplifiés du NoV humain sont confirmés par séquençage après électrophorèse sur gel d'agarose par la TI-ACP conventionnelle ou par lecture de fluorescence de la dégradation de la sonde TaqMan® par l'activité exonucléase de la polymérase Taq pendant le processus d'amplification de la TI-ACP en temps réel. Cette méthode peut être utilisée pour détecter les NoV de génogroupes GI et GII présents dans les échantillons préparés à l'aide de la procédure OPFLP-01 ou de la procédure OPFLP-03.

4. Définition des termes

4.1 Voir l'annexe A du volume 3.

5. Prélèvement des échantillons

5.1 Le nombre d'échantillons varie en fonction des besoins du client (p. ex. collecte de données ou programmes de surveillance) ou à des fins d'enquête (p. ex. éclosions). La suspension clarifiée de NoV a peut-être également déjà été préparée à partir d'échantillons de matières fécales humaines, puis distribuée en portions aliquotes dans des flacons cryogéniques de 2 ml et entreposée à -70°C.

6. Matériel et équipements spéciaux

Note : Le superviseur du laboratoire doit veiller à ce que l'analyse décrite dans la présente méthode soit réalisée conformément à la norme internationale ISO/IEC 17025:2005 (ou la version la plus récente) : « Prescriptions générales concernant la compétence des laboratoires d'étalonnages et d'essais ».

6.1 Thermocycleur (Eppendorf ®Mastercyler® Gradient ou l'équivalent).

6.2 Thermocycleur spectrofluorométrique (série Stratagene® Mx® ou l'équivalent).

6.3 Four à micro-ondes ou plaque chauffante.

6.4 Nécessaire d'électrophorèse pour gels submergés, avec peignes appropriés et bloc d'alimentation.

6.5 Transilluminateur UV de table à ondes courtes pour visualiser l'ADN coloré dans les gels d'agarose.

6.6 Système de photo-documentation (facultatif, pour les documents photographiques), comprenant un appareil Polaroid™ (fixé ou non), une boîte de visualisation, des films Polaroid 667TM ou l'équivalent avec filtres photographiques pour coloration de gel au bromure d'éthidium et/ou du gel SYBR® Safe.

6.7 Micropipettes réglables : 0,5 à 10 µl, 10 à 100 µl et 100 à 1 000 µl, avec embouts appropriés munis de filtres.

6.8 Microcentrifugeuse pour microtubes de 1,5 à 2,0 ml capable d'une vitesse pouvant atteindre 20 000 x g (Labnet International Spectrafuge 16 M ou l'équivalent).

6.9 Blocs chauffants (produits de VWR Scientific ou l'équivalent) ou bain-marie convenant aux microtubes à centrifuger de 1,5 ml et pouvant maintenir des températures de 37 °C à 50 °C.

Note : Il incombe au responsable de chaque laboratoire de veiller à ce que les blocs chauffants et les bains-marie soient maintenus aux températures recommandées. Lorsque la température recommandée est 37 °C, le bain-marie doit être à 37 °C +/- 1 °C. Pour toutes les autres températures, l'écart peut être de +/- 2 °C.

6.10 Mélangeur Vortex.

6.11 Microtubes à centrifuger stériles - 2,0 ml, capacité de 1,5 ml et/ou plaque de 96 puits.

6.12 Tubes pour ACP à paroi mince, capacité de 0,2 ml ou 0,5 ml, languettes ou plaques de 96 puits (selon le modèle de thermocycleur).

6.13 Minuterie.

6.14 Contenant à glace ou plateau de refroidissement.

6.15 Congélateurs pouvant maintenir des températures de -20°C à -70°C.

6.16 Trousse d'extraction de l'ARN viral QIAamp® Viral RNA de Qiagen® (numéro de produit Qiagen® 52904 ou 52906, ou l'équivalent).

6.17 Trousse de la TI-ACP OneStep de Qiagen® (numéro de produit Qiagen® 210210 ou 210212, ou l'équivalent).

6.18 Trousse de réactifs Brilliant® II QRT-PCR Core Reagent Kit, 1-Step de Stratagene® (numéro de produit Stratagene® 600810 ou l'équivalent).

6.19 Éthanol non dénaturé, 96 à 99 % (température ambiante, 23°C +/- 3°C).

6.20 Amorces Kageyama (COG1F et COG1R) pour la détection des NoV de GI au moyen de la méthode de la TI-ACP conventionnelle (voir la section 9.1 pour les séquences d'ADN).

6.21 Amorces Kageyama (COG2F et COG2R) pour la détection des NoV de GII au moyen de la méthode de la TI-ACP conventionnelle (voir la section 9.1 pour les séquences d'ADN).

6.22 Amorces Monroe (MON-431, MON-432, MON-433 et MON-434) pour la détection des NoV de GI et GII au moyen de la méthode de la TI-ACP conventionnelle et de caractérisation moléculaire plus approfondie de la souche du NoV (voir la section 9.1 pour les séquences d'ADN).

6.23 Amorces Kageyama (COG1F et COG1R) et sondes TaqMan® (RING1(a) et RING1(b) pour la détection des NoV GI au moyen de la méthode de la TI-ACP en temps réel (voir la section 10.1 pour les séquences d'ADN).

6.24 Amorces Kageyama (COG2F et COG2R) et sonde TaqMan® (RING2) pour la détection des NoV GII au moyen de la méthode de la TI-ACP en temps réel (voir la section 10.1 pour les séquences d'ADN).

6.26 Trousse d'extraction sur gel QIAquick® (numéro de produit Qiagen® 28704 ou 28706, ou l'équivalent).

6.27 Trousse de clonage TOPO® TA (avec vecteur pCR®2.1-TOPO®) et One Shot® TOP10 Electrocomp™ E. coli (numéro de produit Invitrogen™ K4560-01 ou K4560-40, ou l'équivalent).

6.28 X-GAL (5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-ß-D-Galactopyranoside) (numéro de produit BioShop XGA001 ou l'équivalent).

6.29 Système d'électroperméabilisation (produit Bio-Rad Gene Pulser™ ou l'équivalent).

6.30 Cuvettes d'électroperméabilisation Gene Pulser/MicroPulser, écart de 0,1 cm, (numéro de produit Bio-Rad 165-2089 ou l'équivalent).

6.31 Kanamycine, 10 mg/ml (numéro de produit Invitrogen™ 18161-054 ou l'équivalent).

6.32 Bouillon LB Miller (numéro de produit BioShop LBL407-50 ou l'équivalent).

6.33 Trousse de plasmides NucleoSpin® (numéro de produit Macherey Nagel MCN540788050 ou MCN540788250, ou l'équivalent).

6.34 Endonucléase de restriction EcoRI et tampon (numéro de produit Invitrogen™ 15202-021, ou l'équivalent).

6.35 Endonucléase de restriction BamHI et tampon (numéro de produit Invitrogen™ 15201-031, ou l'équivalent).

6.36 Spectrophotomètre (Thermo Scientific NanoDrop™ 1000 ou l'équivalent).

6.37 Les produits chimiques et les réactifs suivants doivent également être disponibles :

• Solution saline à tampon phosphate (PBS) pH 7,4 (10X) (numéro de produit Gibco 70011 044 ou l'équivalent).
• Diméthylformamide (DMF), qualité réactif (numéro de produit BioShop DMF451 ou l'équivalent).
• Agar (qualité de laboratoire).
• Tubes avec bouchon à pression de 15 ml (p. ex. Falcon).
• Agarose (qualité biologie moléculaire).
• Marqueur de taille des fragments d'ADN en incréments de 100 bp (ou l'équivalent).
• Colorant pour gel au bromure d'éthidium (qualité biologie moléculaire) ou SYBR® Safe (numéro de produit Invitrogen™ S33102 ou l'équivalent).
• Tampon de largage (10X) (tampon de largage sur gel BlueJuice™, numéro de produit Invitrogen™ 10816-015 ou l'équivalent).
• Inhibiteur de RNase (inhibiteur d'ARN RNaseOUT™, 40 U/µl, numéro de produit Invitrogen™ 10777-019 ou l'équivalent).
• Tampon TBE (Tris-Borate-EDTA) 0,5 X ou tampon TAE (Tris-Acétate-EDTA) 1 X. Eau libre de RNase (qualité biologie moléculaire).
• Solution d'ADN de sperme de saumon 10 mg/ml (numéro de produit Invitrogen™ 15632 011 ou l'équivalent.

7. Méthode

7.1 Préparation des suspensions de NoV à partir d'échantillons de matières fécales humaines

7.1.1 Diluer les échantillons de matières fécales dans le tampon PBS pH 7,4 pour obtenir des suspensions de 20 % (p/v).

7.1.2 Homogénéiser vigoureusement les suspensions à l'aide du mélangeur Vortex.

7.1.3 Centrifuger les échantillons à 2 000 x g pendant 3 minutes.

7.1.4 Transférer les surnageants dans des tubes propres.

7.1.5 Homogénéiser vigoureusement les suspensions à l'aide du mélangeur Vortex.

7.1.6 Jeter tout tube d'échantillon déjà utilisé.

7.1.7 Centrifuger les échantillons à 16 000 x g pendant 5 minutes.

7.1.8 Transférer les surnageants dans des tubes propres.

7.1.9 Jeter tout tube d'échantillon déjà utilisé.

7.1.10 Distribuer les suspensions de matières fécales clarifiées en portions aliquotes dans des flacons cryogéniques de 2 ml. Extraire l'ARN viral des suspensions clarifiées ou entreposer à -70 oC jusqu'au moment de l'utilisation.

7.2 Extraction de l'ARN viral des suspensions clarifiées de matières fécales au moyen de la trousse QIAamp® Viral RNA de Qiagen®

Note 1 : Tous les réactifs utilisés dans cette section sont inclus dans la trousse, sauf pour l'éthanol (96 à 99 %) et l'inhibiteur de RNase. Le protocole d'extraction de l'acide nucléique des virus a été mis au point selon les instructions du fabricant également incluses dans la trousse. Dissoudre complètement le tampon AVL avant de l'utiliser. Il est primordial de suivre à la lettre les plus récentes instructions du fabricant qui accompagnent la trousse d'extraction QIAamp® Viral RNA. Les instructions les plus à jour du fabricant auront toujours préséance sur les présentes.

Note 2 : Il faut manipuler très prudemment l'ARN pour éviter tout contact avec des RNase ubiquistes. Les RNase sont très stables et difficiles à inactiver. Toujours entreposer l'ARN extrait avec 20 unités d'inhibiteur de RNase et porter des gants pour manipuler les réactifs et les échantillons. Utiliser des articles en plastique stériles, jetables et libres de RNase. Les articles de verrerie doivent être traités (nettoyer, rincer plusieurs fois et mettre au four à > 240 ºC pendant au moins quatre heures avant de les utiliser).

7.2.1 À l'aide d'une pipette, ajouter 560 µl du tampon AVL préparé contenant l'ARN de transport dans un microtube à centrifuger de 1,5 ml.

Note : Le tampon AVL-ARN de transport doit être préparé peu avant son utilisation; le produit est stable à 2 à 8°C pendant au plus 48 heures.

7.2.2 Ajouter 140 µl de chaque échantillon dans un microtube à centrifuger contenant le tampon AVL-ARN de transport.

Avis de sécurité : Les tampons AVL et AW1 contiennent du sel chaotropique, un irritant. Adopter les mesures de laboratoire appropriées et porter des gants pour les manipuler. Lls ne sont pas compatibles avec les agents désinfectants qui contiennent de l'eau de javel. Jeter toutes les solutions, ainsi que tous les tampons et les réactifs conformément aux lignes directrices sur l'élimination des déchets.

7.2.3 Homogénéiser le contenu des microtubes à l'aide du mélangeur Vortex pendant 15 secondes.

7.2.4 Incuber les échantillons pendant 10 minutes à la température ambiante (23°C +/- 3°C).

7.2.5 Centrifuger brièvement les tubes pour laisser tomber les gouttelettes présentes à l'intérieur du bouchon.

Note : Chaque étape de centrifugation est effectuée à la température ambiante (23 °C +/- 3°C).

7.2.6 Ajouter 560 µl d'éthanol non dénaturé (96 à 99 %) à chaque échantillon.

7.2.7 Homogénéiser le contenu des microtubes à l'aide du mélanger Vortex pendant 15 secondes.

7.2.8 Transférer 630 µl de la solution dans une minicolonne de chromatographie QIAamp® (dans un tube collecteur de 2 ml) sans mouiller le rebord.

7.2.9 Refermer les bouchons et centrifuger les colonnes à 6 000 x g pendant 1 minute.

7.2.10 Transférer chaque colonne dans un tube collecteur propre de 2 ml.

7.2.11 Jeter les tubes collecteurs déjà utilisés.

7.2.12 Transférer l'autre 630 µl de chaque solution dans sa colonne respective.

7.2.13 Centrifuger les colonnes à 6 000 x g pendant 1 minute.

7.2.14 Répéter les étapes 7.2.10 et 7.2.11.

7.2.15 Ajouter 500 µl de tampon AW1 dans chaque colonne et refermer les bouchons.

7.2.16 Centrifuger les colonnes à 6 000 x g pendant 1 minute.

7.2.17 Transférer chaque colonne dans un tube collecteur propre de 2 ml.

7.2.18 Jeter les tubes à échantillons déjà utilisés.

7.2.19 Ajouter 500 µl de tampon AW2 dans chaque colonne et refermer les bouchons.

Avis de sécurité : Les tampons aw2 et ave contiennent de l'azoture de sodium, un agent de préservation très toxique. Adopter les mesures de sécurité appropriées et porter des gants pour les manipuler. Jeter toutes les solutions, ainsi que tous les tampons et les réactifs conformément aux lignes directrices sur l'élimination des déchets.

7.2.20 Centrifuger les colonnes à 20 000 x g pendant 3 minutes.

7.2.21 Placer chaque colonne dans un microtube à centrifuger de 1,5 ml.

7.2.22 Jeter les tubes à échantillons déjà utilisés.

7.2.23 Ajouter 60 µl de tampon AVE dans chaque colonne.

Note : À titre de solution de rechange, ajouter 2 X 30 µl de tampon AVE (élution double); autrement dit, deux applications distinctes de tampon AVE dans chaque minicolonne QIAamp®, suivi d'étapes distinctes de centrifugation à 6 000 x g pendant 1 minute) (8.11).

7.2.24 Refermer les bouchons et incuber à la température ambiante (23°C +/- 3°C) pendant 1 minute.

7.2.25 Centrifuger les colonnes à 6 000 x g pendant 1 minute.

7.2.26 Jeter les colonnes et refermer les bouchons des microtubes à centrifuger de 1,5 ml.

7.2.27 Ajouter 20 unités d'inhibiteur de RNase (0,5 µl de RNaseOUTTM 40 U/µl) à l'ARN extrait.

7.2.28 Utiliser l'ARN directement dans la méthode de la TI-ACP conventionnelle ou dans la méthode de la TI-ACP en temps réel ou entreposer l'ARN à - 70°C jusqu'au moment de l'utiliser.

7.3 Manipulation de l'ARN extrait des échantillons

7.3.1 Pendant l'entreposage et le transport, garder congelé (-70°C) l'ARN extrait des échantillons.

7.3.2 L'ARN extrait doit être conservé sur glace pendant la préparation des réactions de la TI ACP conventionnelle ou en temps réel.

7.4 Préparation en vue de l'analyse

7.4.1 Veiller à ce que tous les réactifs nécessaires soient disponibles.

7.4.2 Préparer et vérifier tous les témoins. Inclure un témoin d'amplification négatif et un témoin d'amplification positif pour les analyses de la TI-ACP (conventionnelle ou en temps réel) spécifiques au jeu d'amorces utilisées. Les témoins d'amplification négatifs utilisent de l'eau pour éviter toute contamination du mélange d'ACP. Les témoins d'amplification positifs utilisent de l'ARN des NoV de GI et/ou GII préalablement confirmé positif dans d'autres expériences ou un clone d'ADN complémentaire (ADNc) correspondant (11.7) pour veiller à ce que les réactifs et les amorces d'ACP aient la spécificité visée.

7.4.3 Le titre du NoV peut être estimé au moyen d'une méthode de la TI-ACP conventionnelle. Le titre est ensuite exprimé en unités de la TI-ACP. Dégeler sur glace un flacon cryogénique de 2 ml contenant l'ARN des NoV de GI et/ou GII. Après la décongélation, préparer des dilutions en série (au dixième) du virus en ajoutant 100 µl de suspension-mère du virus à 900 µl d'eau libre de RNase dans un microtube à centrifuger de 1,5 ml (dilution virale de 10^-1). Répéter cette étape en prélevant 100 µl de la dilution virale de 10^-1 pour l'ajouter à 900 µl libre de RNase dans un autre à centrifuger de 1,5 ml (dilution virale de 10^-2). Répéter l'étape précédente jusqu'à l'obtention d'une dilution virale de 10^-8.

7.4.4 Une courbe d'étalonnage pour les systèmes de la TI-ACP en temps réel est générée en trois exemplaires à l'aide de la série de dilutions au dixième (équivalents génomiques de 108 à 100) du plasmide linéaire d'ADNc purifié (11.6 et 11.7) contenant le produit d'ACP obtenu avec chaque jeu d'amorces respectivement dans une solution d'ADN de sperme de saumon (5 ng/ml). Après la décongélation, préparer des dilutions en série (au dixième) du plasmide d'ADNc en ajoutant 10 µl de suspension de plasmide à 90 µl d'eau libre de RNase contenant la solution d'ADN de sperme de saumon (5 ng/ml) dans un microtube à centrifuger de 1,5 ml (dilution virale de 10^-1). Répéter cette étape en prélevant 10 µl de la dilution de plasmide d'ADNc 10^-1 pour l'ajouter à 90 µl de RNase contenant la solution d'ADN de sperme de saumon (5 ng/ml) dans un autre microtube à centrifuger de 1,5 ml (dilution de 10^-2). Répéter l'étape précédente jusqu'à l'obtention d'une dilution de 10^-8.

7.5 Méthode de la TI-ACP conventionnelle pour l'amplification de l'ARN des NoV

7.5.1 Amplifier l'ARN de chaque échantillon dont l'ARN a été extrait à l'aide du jeu d'amorces des NoV (Kageyama GI COG1F/COG1R et/ou Kageyama GII COG2F/COG2R; et/ou MON 431/MON 432/MON 433/MON 434) et de la trousse OneStep de la TI-ACP de Qiagen®.

7.5.2 Ajouter 5,0 µl de chaque échantillon dont l'ARN a été extrait dans 20,0 µl du mélange de réaction de la TI-ACP (9.3).

7.5.3. Préparer un témoin négatif en ajoutant 5,0 µl d'eau libre de RNase dans 20,0 µl du même mélange de réaction de la TI-ACP (9.3). Pour les témoins positifs, ajouter 5,0 µl d'ARN des NoV dans 20,0 µl du même mélange de réaction de la TI-ACP.

7.5.4 Placer les tubes ACP ou la plaque à 96 puits dans un thermocycleur et procéder à l'amplification de la TI-ACP selon le programme décrit à la section 9.2.

7.5.5 Une fois l'amplification de la TI-ACP complétée, analyser le produit de la TI-ACP par électrophorèse sur gel d'agarose (7.6). Si nécessaire, les amplicons peuvent être entreposés à 4°C jusqu'au moment de l'analyse.

7.6 Électrophorèse sur gel d'agarose

7.6.1. Préparer un gel d'agarose 3,0 % (p/v) dans du tampon TBE (Tris-Borate-EDTA) 0,5 X ou de tampon TAE (Tris-Acétate-EDTA) 1 X. L'agarose peut être dissout en le mélangeant sur une plaque chauffante ou au four micro-ondes pendant 1 à 2 minutes à puissance élevée. Veiller à ce que l'agarose soit complètement dissout (c.-à-d. un liquide clair sans particules en suspension).

7.6.2. Refroidir l'agarose à environ 45°C avant d'ajouter la solution concentrée de bromure d'éthidium pour obtenir une concentration finale de 0,5 µg/ml dans le gel d'agarose. Mélanger doucement tout en évitant de former des bulles.

Note 1 : Le colorant de gel SYBR® Safe peut être utilisé au lieu du bromure d'éthidium. Diluer le colorant concentré pour obtenir une dilution finale de 1:10 000 dans le gel d'agarose (8.14).

Note 2 : L'ajout du colorant de gel de bromure d'éthidium/SYBR® Safe au gel est facultatif, si le gel est submergé dans la solution de bromure d'éthidium/SYBR® Safe DNA après migration.

Note 3 : Sélectionner le filtre photographique qui convient à l'utilisation du colorant de gel de bromure d'éthidium ou SYBR® Safe.

Avis de sécurité : Le bromure d'éthidium est un puissant mutagène : Porter des gants de nitrile pour le manipuler. Jeter toutes les solutions, ainsi que tous les tampons et les réactifs conformément aux lignes directrices sur l'élimination des déchets.

7.6.3. Transvider dans un plateau pour gel. Éviter toute formation de bulles ou tout piégeage de bulles. Ajouter un peigne pour former les puits et laisser le gel se solidifier pendant environ 20 à 30 minutes.

7.6.4. Préparer les échantillons pour l'électrophorèse : dans des microtubes propres, mélanger 1,2 µl de colorant de repérage (tampon largage 10 X) dans chaque microtube contenant 10 µl de produit de la TI-ACP.

7.6.5. Une fois le gel d'agarose solidifié, retirer le peigne et placer le plateau avec le gel dans l'appareil à électrophorèse et remplir le réservoir avec suffisamment de tampon TBE 0,5 X ou TAE 1 X pour couvrir la surface du gel (profondeur de 4 mm). Pipetter soigneusement les échantillons (environ 11,2µl) (7.6.4) pour l'électrophorèse dans les puits du gel submergé. Pipetter un échantillon de marqueur de masse moléculaire (marqueur de taille des fragments d'ADN en incréments de 100 bp) dans un puits vide, ainsi que des témoins positifs, négatifs et de réactifs.

7.6.6. Relier l'appareil au bloc d'alimentation, la cathode (-, noire) placée dans la partie supérieure du gel (près des puits d'échantillons) et l'anode (+, rouge) placée dans la partie inférieure (à la fin du gel). Appliquer environ 100 volts de tension sur le gel et faire fonctionner l'appareil pendant environ 30 minutes ou jusqu'à ce que le colorant ait migré une distance d'environ deux-tiers de la longueur du gel.

Note : La tension et le temps de migration peuvent être modifiés en fonction de la taille du dispositif d'électrophorèse (distance entre les électrodes) et la longueur du gel.

7.6.7 Retirer le gel du plateau et visualiser les bandes d'ADN par exposition à la lumière UV (ondes courtes) à l'aide d'un transilluminateur. Les gels peuvent être photographiés sur film Polaroid™ 667 pour faciliter l'analyse et aux fins de conservation de dossiers. À titre de solution de rechange, un système de traitement numérique peut être utilisé.

Note : Si le colorant de bromure d'éthidium/SYBR® Safe n'a pas été directement ajouté au gel, le gel doit être retiré du plateau pour colorer l'ADN en plaçant le gel dans une solution de bromure d'éthidium (10 µg/ml) ou de SYBR™ Safe 1 X pendant 15 minutes. Retirer le gel de la solution de bromure d'éthidium ou de SYBR™ Safe DNA à l'aide d'une écope de gel, rincer brièvement à l'eau du robinet et visualiser les bandes d'ADN par exposition à la lumière UV.

Avis de sécurité : La lumière uv peut endommager les yeux; porter des lunettes de sécurité.

7.7 Interprétation des résultats - méthode de la TI-ACP conventionnelle

7.7.1 Les amplicons (produits de la TI-ACP) générés par les amorces des NoV Kageyama GI COG1F/COG1R, Kageyama GII COG2F/COG2R et MON 431/MON 432/MON 433/MON 434) sont des fragments d'ADN à double brin de 85 bp, 98 bp et 213 bp, respectivement. Par conséquent, une analyse d'ACP positive produit un fragment d'ADN spécifique pour la séquence du gène ciblé et apparaît comme une bande intense sur le gel d'agarose coloré avec le bromure d'éthidium/SYBR™ Safe. La taille moléculaire de la bande peut être vérifiée en comparant sa migration à celle d'un marqueur de taille moléculaire d'ADN (p. ex. marqueur de taille des fragments d'ADN en incréments de 100 bp) analysé sur le même gel.

7.7.2 Une analyse d'ACP négative ne produit normalement aucune bande visible sur le gel d'agarose coloré avec le bromure d'éthidium/SYBR™ Safe DNA. Même dans un cas extrêmement rare, tout échantillon produisant des bandes qui ne correspondent pas à l'amplicon recherché (produits d'amplification non spécifiques) est considéré négatif.

7.7.3 Une bande spécifique devrait apparaître pour le témoin positif ciblé. L'absence d'une bande pour le témoin positif invalide le test et les échantillons doivent être amplifiés de nouveau.

7.7.4 Toute bande correspondant au témoin positif qui apparaît pour le témoin négatif avec le jeu d'amorces des NoV indique une possibilité de contamination de l'échantillon par le mélange de réaction de la TI-ACP; le lot complet est considéré comme douteux et il doit être éliminé. Les échantillons doivent être amplifiés de nouveau avec un nouveau lot de réactifs.

7.7.5 Tout échantillon d'essai montrant une bande distincte avec le jeu d'amorces des NoV qui correspond à son témoin positif est présumé positif. Étant donné que des amplifications non spécifiques de taille appropriée ont à l'occasion été observées dans des échantillons d'aliments, cliniques ou prélevés dans l'environnement au moyen d'une technique de la TI-ACP conventionnelle à l'aide des amorces Kageyama et Monroe, les produits de la TI-ACP conventionnelle doivent être confirmés à titre de souche des NoV par séquençage.

Note : Pour les échantillons d'aliments, il est conseillé d'envoyer l'ARN extrait des échantillons positifs au Bureau des dangers microbiens (Santé Canada) pour caractérisation moléculaire plus approfondie de la souche de NoV.

7.8 Calcul des unités de la TI-ACP

7.8.1 Après avoir lu les résultats de la TI-ACP (7.7), déterminer la plus haute dilution de NoV (7.4.3) qui montre un résultat positif (7.7.5) aussi appelée dilution limite.

7.8.2 Après avoir déterminé la dilution limite, prendre le réciproque de cette dilution pour obtenir les unités de la TI-ACP par quantité utilisée pour la TI-ACP (c.-à-d. 5,0 µl).

7.8.3 Pour obtenir une concentration par ml, multiplier la concentration obtenue à l'étape 7.8.2 par un facteur qui donnera 1 000 µl ou 1 ml (p. ex. si 5,0 µl d'ARN a été utilisé pour la TI-ACP et si 10-6 était la plus haute dilution montrant une bande, multiplier 106 par 200). Par conséquent, les unités de la TI-ACP sont 2,0 x 108 unités de la TI-ACP par ml.

7.9 Méthode de la TI-ACP en temps réel pour l'amplification de l'ARN des NoV

7.9.1 En double, amplifier l'ARN de chaque échantillon dont l'ARN a été extrait avec le jeu d'amorces des NoV Kageyama et des sondes TaqMan® (GI : COG1F, COG1R, RING1(a), RING1(b); GII : COG2F, COG2R, RING2) à l'aide de la trousse de réactifs Brilliant® II QRT-PCR Core Reagent Kit, 1-Step de Stratagene® ou l'équivalent. Effectuer, en triple, au moins 5 à 6 points de la courbe d'étalonnage validée correspondante de concentration connue des nombres de la copie.

7.9.2 Ajouter 2,0 µl de chaque échantillon ou clone dont l'ARN extrait a été utilisé pour la courbe d'étalonnage dans 23,0 µl de mélange de réaction de la TI-ACP en temps réel (10.3).

7.9.3. Préparer les témoins de réaction en triple. Pour le témoin sans matrice (NTC), ajouter 2,0 µl d'eau libre de RNase à 23,0 µl du même mélange de réaction de la TI-ACP en temps réel (10.3). Pour le témoin positif, ajouter 2,0 µl de l'ARN des NoV déjà confirmée positif dans d'autres expériences ou d'ADNc du clone correspondant à 23,0 µl du même mélange de réaction de la TI-ACP en temps réel. Pour une réaction de la TI-ACP en deux étapes, un témoin non TI peut être inclus en omettant l'enzyme de transcription inverse dans la réaction de la TI. Le témoin non TI ne devrait générer aucun signal d'ACP en temps réel avec les amorces spécifiques, la sonde et l'ARN génomique des NoV déjà confirmé.

7.9.4 Insérer les tubes de bandes de la TI ou la plaque à 96 puits dans le thermocycleur spectrofluorométrique et procéder à l'amplification de la TI-ACP conformément au programme décrit dans la section 10.2. Prendre des lectures de fluorescence à la température d'hybridation/d'extension (60°C).

7.9.5 Après avoir complété l'analyse de la TI-ACP en temps réel, analyser les réactions à l'aide du logiciel de la série MX® ou du logiciel fourni avec le thermocycleur spectrofluorométrique. Si nécessaire, les amplicons peuvent être entreposés à 4°C pour analyse ultérieure.

7.10 Interprétation des résultats - méthode de la TI-ACP en temps réel

7.10.1 Les résultats sont affichés sur un graphique d'amplification qui reflète le changement de fluorescence pendant le cycle. Un résultat positif de la TI-ACP en temps réel génère un Ct (cycle de seuil) dérivé d'une fluorescence brute ou d'une fluorescence normalisée (à l'aide du colorant de référence Rox™). Pendant l'ACP, le fluorochrome produit une lumière fluorescente (dégradation de la sonde TaqMan®) d'une couleur caractéristique du fluorochrome utilisé et qui dépasse la fluorescence de fond produite par la sonde en absence d'amplification. Le Ct est défini comme le cycle au cours duquel la fluorescence est déterminée comme statistiquement importante au-dessus du signal de fond contribué par l'oligonucléotide marqué par la fluorescence dans la réaction d'ACP. Rechercher toute anormalité sur le graphique d'amplification.

7.10.2 Si une courbe d'étalonnage est utilisée, la gamme de concentration recherchée de l'échantillon devrait cadrer dans la gamme de concentration de la courbe d'étalonnage. Idéalement, les valeurs du Ct devraient se situer entre 15 et 35. Un graphique de Ct, par rapport au logarithme du nombre de copies correspondant à ce Ct, produit une ligne droite. Une analyse d'ACP en temps réel efficace montre une pente de -3,3, un point d'interception d'environ 38 et un R2 supérieur à 0,98. L'efficacité de l'amplification devrait être entre 90 et 110 % (les courbes d'étalonnage optimales sont fondées sur des efficacités d'amplification qui se situent le plus près possible de 100 %).

7.10.3 Une analyse négative de la TI-ACP en temps réel ne produit normalement aucune fluorescence au-dessus du signal de fond de la sonde pour toute la durée de la réaction. Le résultat négatif est validé à l'aide d'un témoin positif.

7.10.4 À un Ct spécifique préalablement validé, la fluorescence d'un témoin positif devrait augmenter au-dessus de la fluorescence de fond. L'absence de fluorescence dans le témoin positif invalide le test et les échantillons doivent être amplifiés de nouveau.

7.10.5 Tout Ct démontré dans le témoin négatif avec les amorces et la sonde des NoV indique une possibilité de contamination du mélange de réaction de la TI-ACP en temps réel par un échantillon; le lot complet est considéré comme douteux et il doit être éliminé. Les échantillons doivent être amplifiés de nouveau avec un nouveau lot de réactifs.

7.10.6 Tout échantillon est considéré comme positif, s'il montre un Ct avec les amorces des NoV et la sonde lorsque les NTC sont négatifs ou si le Ct des NTC = 5 cycles à partir de la valeur de Ct la plus élevée des échantillons analysés.

Note : Pour les échantillons d'aliments, il est conseillé d'envoyer l'ARN extrait des échantillons positifs au Bureau des dangers microbiens (Santé Canada) pour caractérisation moléculaire plus approfondie de la souche des NoV.

7.11 Calcul des unités génomiques équivalentes

7.11.1 La valeur de Ct d'un échantillon inconnu doit cadrer dans la courbe d'étalonnage pour être quantifiée en équivalents génomiques/volume. Les valeurs initiales d'équivalent génomique de l'ADNc peuvent être estimées selon la moyenne du cycle de seuil (Ct) de l'échantillon analysé en double, comparativement à sa courbe d'étalonnage respective (NoV de GI ou GII).

7.11.2 Pour obtenir la concentration initiale en équivalents génomiques par µl, diviser la concentration obtenue à l'étape 7.11.1 par le volume d'ARN utilisé comme matrice (p. ex. si 2,0 µl d'ARN a été utilisé pour la réaction de la TI-ACP en temps réel et la valeur moyenne de Ct obtenue correspond à 4,0 x 106 les équivalents génomiques de la courbe d'étalonnage, diviser 4,0 x 106 équivalents génomiques par 2 µl. Par conséquent, la concentration est 2,0 x 106 équivalents génomiques par µl).

Note : Les concentrations d'ARN viral sont habituellement exprimées en termes d'équivalent génomique par µl d'ARN utilisé comme matrice. À l'aide des calculs appropriés, elles peuvent être exprimées comme un équivalent génomique par unité de l'échantillon analysé.

8. Références

Certains hyperliens donnent accès à des sites d'un organisme qui n'est pas assujetti à la Loi sur les langues officielles. L'information qui s'y trouve est donc dans la langue du site.

8.1 Anderson A.D., Heryford A.G., Sariski J.P., Higgins C., Monroe S.S., Beard R.S., Newport C.M., Cashdollar J.L., Fout G.S., Robbins D.E., Seys S.A., Musgrave K.J., Medus C., Vinjé J., Bresee J.S., Mainzer H.M. et R.I. Glass. 2003. A waterborne outbreak of Norwalk-like virus among snowmobilers - Wyoming 2001. Journal of Infectious Diseases 187 : pages 303 à 306.

8.2 Manuel d'instructions (2006) - Trousse de réactifs Brilliant® II QRT-PCR Core Reagent OneStep de Stratagene®. Disponible à l'adresse : http ://www.stratagene.com/manuals/600810.pdf.

8.3 David S.T., McIntyre L., MacDougall L., Fyfe M., Kelly D., Liem S., Schallié K., McNabb A., Houde A., Müller P., Ward P., Trottier Y.-L. et J. Brassard. 2007. An outbreak of norovirus caused by consumption of oysters from geographically disperse harvest sites, British Columbia, Canada, 2004. Foodborne Pathogens and Disease 4 : pages 349 à 358.

8.4 Guèvremont E., Brassard J., Houde A., Simard C. et Y.-L. Trottier. 2006. Development of an extraction and concentration procedure and comparison of RT-PCR primer systems for the detection of hepatitis A virus and norovirus GII in green onions. Journal of Virological Methods 134 : pages 130 à 135.

8.5 Houde A., Leblanc D., Poitras E., Ward P., Brassard J., Simard C. et Y.-L. Trottier. 2006. Comparative evaluation of RT-PCR, nucleic acid sequence based amplification (NASBA) and real-time RT-PCR for detection of noroviruses in faecal material. Journal of Virological Methods 135 : pages 163 à 172.

8.6 Jothikumar N., Lowther J.A., Henshilwood K., Lees D.N., Hill V.R. et J. Vinjé. 2005. Rapid and sensitive detection of Noroviruses by using TaqMan-based one-step reverse transcription-PCR assays and application to naturally contaminated shellfish samples. Applied and Environmental Microbiology 71 : pages 1870 à 1875.

8.7 Kageyama T., Kojima S., Shinohara M., Uchida K., Fukushi S., Hoshino F.B., Takeda N. et K. Katayama. 2003. Broadly Reactive and Highly Sensitive Assay for Norwalk-Like Viruses Based on Real-Time Quantitative Reverse Transcription-PCR. Journal of Clinical Microbiology 41 : pages 1548 à 1557.

8.8 Loisy F., Atmar R.L., Guillon P., Le Cann P., Pommepuy M. et F.S. Le Guyader. 2005. Real-time RT-PCR for norovirus screening in shellfish. Journal of Virological Methods 123 : pages 1 à 7.

8.9 Manuel de l'utilisateur - Trousse de plasmides NucleoSpin®. Mars 2008. Disponible à l’adresse : http ://www.mn-net.com/Portals/8/attachments/Redakteure_Bio/Protocols/Plasmid %20DNA %20Purification/UM_pDNA_NS.pdf

8.10 Pang X.L., Preiksaitis J.K. et B. Lee. 2005. Multiplex real time RT-PCR for the detection and quantitation of norovirus genogroups I and II in patients with acute gastroenteritis. Journal of Clinical Virology 33 : pages 168 à 171.

8.11 Miniguide - Trousse d'ARN viral QIAamp®. Décembre 2007. Disponible à l’adresse : http://www1.qiagen.com/literature/handbooks/literature.aspx?id=1000199

8.12 Guide - Trousse de la TI-ACP Qiagen® OneStep. Février 2008. Disponible à l’adresse : http://www1.qiagen.com/literature/handbooks/literature.aspx?id=1000223

8.13 Guide - QIAquick® Spin. Mars 2008. Pages 25 et 26. Disponible à l’adresse : http://www1.qiagen.com/literature/handbooks/literature.aspx?id=1000252

8.14 Colorant de gel SYBR™ Safe DNA. Juillet 2006. Disponible à l’adresse : http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp33100.pdf

8.15 Manuel de l'utilisateur - TOPO TA Cloning®. Avril 2006. Disponible à l’adresse : http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/topota_man.pdf

8.16 Trujillo A.A., McCaustland K.A., Zheng D.P., Hadley L.A., Vaughn G., Adams S.M., Ando T., Glass R.I. et S.S. Monroe. 2006. Use of TaqMan real-time reverse transcription-PCR for rapid detection, quantification, and typing of noroviruses. Journal of Clinical Microbiology 44 : pages 1405 à 1412.

9. Amorces et programme de cycles de température pour la méthode de la TI ACP conventionnelle

9.1 Amorces de la TI-ACP

Amorces Kageyama (8.7) pour la détection des NoV de GI (fragment de 85 bp) :
COG1F (sens) 20 bases = 5' - CGY TGG ATG CGI TTY CAT GA - 3'
COG1R (antisens) 22 bases = 5' - CTT AGA CGC CAT CAT CAT TYA C -3'

Amorces Kageyama (8.7) pour la détection des NoV de GII (fragment de 98 bp) :
COG2F (sens) 26 bases = 5' - CAR GAR BCI ATG TTY AGR TGG ATG AG - 3'
COG2R (antisens) 21 bases = 5' - TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA -3'

Amorces Monroe (8.1) pour la détection et la caractérisation moléculaire des NoV de GI et GII (fragment de 213 bp) :
MON431 (sens) 20 bases = 5' - TGG ACI AGR GGI CCY AAY CA - 3'
MON432 (sens) 20 bases = 5' - TGG ACI CGY GGI CCY AAY CA -3'
MON433 (antisens) 21 bases = 5' - GAA YCT CAT CCA YCT GAA CAT - 3'
MON434 (antisens) 21 bases = 5' - GAA SCG CAT CCA RCG GAA CAT -3'

Composition des mélanges de base standard

Lettre	Nucléotides	Lettre	Nucléotides
R	A, G	H	A, C, T
Y	C, T	B	C, G, T
M	A, C	V	A, C, G
K	G, T	D	A, G, T
S	C, G	N (I)	A, C, G, T
W	A, T	X	A, C, G, T

Note : La synthèse des amorces oligonucléotidiques peut habituellement être impartie à une université locale; plusieurs sociétés biotechnologiques offrent également un service personnalisé de synthèse. Communiquer avec les auteurs pour obtenir de l'aide à cet égard.

9.2 Programme de cycles de température pour les amorces des NoV

Pour le système d'amorces Kageyama pour les NoV de GI et GII, régler le programme du thermocycleur pour la séquence suivante des paramètres de cycle :

Étape 1
Transcription inverse
30 minutes
50°C

Étape 2
Étape initiale d'activation de l'ACP
15 minutes
95°C
La polymérase d'ADN HotStarTaq® est activée; les transcriptases inverses Omniscript® et Sensiscript® sont inactivées et la matrice d'ADNc est dénaturée (8.6).

Étape 3
40 cycles de :

• Étape 3.1 Dénaturation 30 secondes 94°C
• Étape 3.2 Hybridation 30 secondes 52°C
• Étape 3.3 Extension 45 secondes 72°C

Étape 4
Élongation finale
5 minutes
72°C

Note 1 : L'utilisation de thermocycleurs autres que les modèles énumérés plus haut ou l'utilisation d'une trousse de réactifs de la TI-ACP autre que la trousse de la TI-ACP Qiagen® OneStep peut modifier le rendement des réactions de la TI-ACP. L'utilisateur devra peut-être optimiser les paramètres de cycle en fonction du modèle ou de la trousse de réactifs.

Note 2 : Pour obtenir de meilleurs résultats, il est conseillé d'utiliser des amorces purifiées par chromatographie en phase liquide à haute pression/chromatographie liquide à haute performance (CLHP).

Pour le système d'amorces Monroe pour les NoV de Gi et GII, régler le programme du thermocycleur pour la séquence suivante des paramètres de cycle :

Étape 1
Transcription inverse 30 minutes
50°C

Étape 2
Étape initiale d'activation de l'ACP
15 minutes
95°C
La polymérase d'ADN HotStarTaq® est activée; les transcriptases inverses Omniscript® et Sensiscript® sont inactivées et la matrice d'ADNc est dénaturée (8.6).

Étape 3
40 cycles de :

• Étape 3.1 Dénaturation 30 secondes 94°C
• Étape 3.2 Hybridation 30 secondes 52°C
• Étape 3.3 Extension 45 secondes 72°C

Étape 4
Élongation finale
5 minutes
72°C

Note 1 : L'utilisation de thermocycleurs autres que les modèles énumérés plus haut ou l'utilisation d'une trousse de réactifs de la TI-ACP autre que la trousse de la TI-ACP Qiagen® OneStep peut modifier le rendement des réactions de la TI-ACP. L'utilisateur devra peut-être optimiser les paramètres de cycle en fonction du modèle ou de la trousse de réactifs.

Note 2 : Pour obtenir de meilleurs résultats, il est conseillé d'utiliser des amorces purifiées par chromatographie en phase liquide à haute pression/chromatographie liquide à haute performance (CLHP).

9.3 Trousse de la TI-ACP Qiagen® OneStep (8.12)

Toutes les solutions sont entreposées à -20°C jusqu'au moment de l'utilisation. Voici la recette pour préparer un mélange suffisant pour 20 réactions.

Note 1 : Le protocole d'amplification de la TI-ACP a été établi selon les instructions du fabricant incluses dans la trousse. Il est primordial de suivre à la lettre les plus récentes instructions du fabricant qui accompagnent la trousse de la TI-ACP Qiagen® OneStep. Les instructions les plus à jour du fabricant auront toujours préséance sur les présentes.

Note 2 : Il faut manipuler très prudemment l'ARN pour éviter tout contact avec des RNase ubiquistes. Les RNase sont très stables et difficiles à inactiver. Toujours entreposer l'ARN extrait avec 20 unités d'inhibiteur de RNase et porter des gants pour manipuler les réactifs et les échantillons. Utiliser des articles en plastique stériles, jetables et libres de RNase. Les articles de verrerie doivent être traités (nettoyer, rincer plusieurs fois et mettre au four à > 240ºC pendant au moins quatre heures avant de les utiliser).

Note 3 : Tous les réactifs, ainsi que l'eau libre de DNase/RNase, les embouts de pipette et tout autre matériel qui entre en contact avec les échantillons ou les réactifs de la TI-ACP doivent être stériles ou passés à l'autoclave avant leur utilisation pour éliminer toute DNase et/ou autre contaminant. Pour éviter tout problème de contamination, préparer tous les réactifs dans une hotte à flux laminaire qui n'a jamais été exposée aux NoV ou aux produits des NoV par la TI ACP. Pour éviter toute amplification non spécifique, préparer le mélange en plaçant tous les réactifs sur glace ou sur un plateau réfrigéré. Pour réduire le coût des réactifs, utiliser 25 µl du mélange de la TI-ACP dans des tubes de 200 µl.

Composantes de la TI ACP	Concentration initiale	Solutions mères requises pour 20 réactions à l'aide des amorces Kageyama pour les NoV de GI ou GII	Volume par tube	Concentration finale
Eau libre de RNase		200,0 µl	10,0 µl
Tampon 5 X de la TI ACP QIAGEN® OneStep	5 X	100,0 µl	5,0 µl	1 X
Mélange dNTP	10 mM de chaque dNTP	20,0 µl	1,0 µl	400 µM
Amorce COG1F ou COG2F	10 µM	30,0 µl	1,5 µl	0,6 µM
Amorce COG1R ou COG2R	10 µM	30,0 µl	1,5 µl	0,6 µM
Mélange d'enzyme de la TI-ACP QIAGEN® OneStep		20,0 µl	1,0 µl
Volume total		400,0 µl	20,0 µl
Distribuer par tube		20,0 µl
Gabarit par tube			5,0 µl

Composantes de la TI ACP	Concentration initiale	Solutions mères requises pour 20 réactions à l'aide des amorces Monroe pour les NoV de GI ou GII	Volume par tube	Concentration finale
Eau libre de RNase		140,0 µl	7,0 µl
Tampon 5 X de la TI ACP QIAGEN® OneStep	5 X	100,0 µl	5,0 µl	1 X
Mélange dNTP	10 mM de chaque dNTP	20,0 µl	1,0 µl	400 µM
Amorce MON431	10 µM	30,0 µl	1,5 µl	0,6 µM
Amorce MON432	10 µM	30,0 µl	1,5 µl	0,6 µM
Amorce MON433	10 µM	30,0 µl	1,5 µl	0,6 µM
Amorce MON434	10 µM	30,0 µl	1,5 µl	0,6 µM
Mélange d'enzyme de la TI-ACP QIAGEN® OneStep		20,0 µl	1,0 µl
Volume total		400,0 µl	20,0 µl
Distribuer par tube		20,0 µl
Gabarit par tube			5,0 µl

10. Amorces et programme de cycles de température pour la méthode de la TI ACP en temps réel

10.1 Amorces et sonde de la TI-ACP en temps réel

Amorces Kageyama (8.7) pour la détection des NoV de GI (fragment de 85 bp) par analyse TaqMan® :
COG1F (sens) 20 bases = 5' - CGY TGG ATG CGI TTY CAT GA - 3'
COG1R (antisens) 22 bases = 5' - CTT AGA CGC CAT CAT CAT TYA C - 3'

Sondes Kageyama (8.7) pour la détection des NoV de GI par analyse TaqMan® :
RING1(a) 20 bases = 5' - AGA TYG CGA TCY CCT GTC CA - 3'
RING1(b) 20 bases = 5' - AGA TCG CGG TCT CCT GTC CA - 3'

Note 1 : La synthèse des amorces oligonucléotidiques peut habituellement être impartie à une université locale; plusieurs sociétés biotechnologiques offrent également un service personnalisé de synthèse. Pour les applications de la TI-ACP en temps réel, il est conseillé de commander des oligonucléotides qui ont été purifiées par chromatographie en phase liquide à haute pression/ haute performance (CLHP). Communiquer avec les auteurs pour obtenir de l'aide à cet égard.

Note 2 : Les sondes RING1(a) et RING1(b) de TaqMan® ont été commandées comme 5'HEX™ (Hexachlorofluorescéine) - 3'IBQ™ (Iowa Black Quencher). Différentes autres combinaisons de fluorochrome/traitement sont possibles. La synthèse des sondes TaqMan® peut habituellement être impartie à une université locale; plusieurs sociétés biotechnologiques offrent également un service personnalisé de synthèse. Communiquer avec les auteurs pour obtenir de l'aide à cet égard.

Amorces Kageyama (8.7) pour la détection des NoV de GII (fragment de 98 bp) par analyse TaqMan® :
COG2F (sens) 26 bases = 5' - CAR GAR BCI ATG TTY AGR TGG ATG AG - 3'
COG2R (antisens) 21 bases = 5' - TCG ACG CCA TCT TCA TTC ACA - 3'

Sonde Kageyama (8.7) ur la détection des NoV de GII par analyse TaqMan®:
RING2 30 bases = 5' - TGG GAG GGC GAT CGC AAT CT - 3'

Composition des mélanges de base standard

Lettre	Nucléotides	Lettre	Nucléotides
R	A, G	H	A, C, T
Y	C, T	B	C, G, T
M	A, C	V	A, C, G
K	G, T	D	A, G, T
S	C, G	N (I)	A, C, G, T
W	A, T	X	A, C, G, T

Note 1 : La synthèse des amorces oligonucléotidiques peut habituellement être impartie à une université locale; plusieurs sociétés biotechnologiques offrent également un service personnalisé de synthèse. Pour les applications de la TI-ACP en temps réel, il est conseillé de commander des oligonucléotides qui ont été purifiées par chromatographie en phase liquide à haute pression/chromatographie liquide à haute performance (CLHP). Communiquer avec les auteurs pour obtenir de l'aide à cet égard.

Note 2 : La sonde RING2 TaqMan® a été commandée comme 5'HEX™ (Hexachlorofluorescéine) - 3'IBQ™ (Iowa Black Quencher). Différentes autres combinaisons de fluorochrome/traitement sont possibles. La synthèse des sondes TaqMan® peut habituellement être impartie à une université locale; plusieurs sociétés biotechnologiques offrent également un service personnalisé de synthèse. Communiquer avec les auteurs pour obtenir de l'aide à cet égard.

10.2 Programme de cycle de température pour le jeu d'amorces et la sondes NoV

Pour le jeu d'amorces et la sonde Kageyama pour les NoV de GI, régler le programme du thermocycleur spectrofluorométrique pour la séquence suivante des paramètres de cycle :

Étape 1
Transcription inverse
30 minutes
50°C

Étape 2
Étape initiale d'activation de l'ACP
10 minutes
95°C
La polymérase d'ADN SureStart Taq® est activée; la transcriptase inverse est inactivée et la matrice d'ADNc est dénaturée (8.1).

Étape 3
45 cycles de :

• Étape 3.1 Dénaturation 15 secondes 95°C
• Étape 3.2 Hybridation +
  Extension 60 secondes 60°C

Note : L'utilisation de thermocycleurs spectrofluorométriques autres que les modèles énumérés plus haut ou l'utilisation d'une trousse de réactifs de la TI-ACP autre que la trousse de réactifs Brilliant® II QRT-PCR Core Reagent OneStep de Stratagene® peut modifier le rendement des réactions de la TI-ACP. L'utilisateur devra peut-être optimiser les paramètres de cycle en fonction du modèle ou de la concentration des amorces, de la sonde ou du MgCl₂.

10.3 Trousse de réactifs Brilliant® II QRT-PCR Core Reagent OneStep de Stratagene® (8.2)

Toutes les solutions mères sont entreposées à -20°C jusqu'au moment de l'utilisation. Voici la recette pour préparer un mélange suffisant pour 102 réactions pour une plaque de 96 puits.

Note 1 : Le protocole d'amplification de la TI-ACP en temps réel a été établi selon les instructions du fabricant incluses dans la trousse. Il est primordial de suivre à la lettre les plus récentes instructions du fabricant qui accompagnent la trousse de réactifs Brilliant® II QRT-PCR Core Reagent OneStep de Stratagene®. Les instructions les plus à jour du fabricant auront toujours préséance sur les présentes.

Note 2 : Il faut manipuler très prudemment l'ARN pour éviter tout contact avec des RNase ubiquistes. Les RNase sont très stables et difficiles à inactiver. Toujours entreposer l'ARN extrait avec 20 unités d'inhibiteur de RNase et porter des gants pour manipuler les réactifs et les échantillons. Utiliser des articles en plastique stériles, jetables et libres de RNase. Les articles de verrerie doivent être traités (nettoyer, rincer plusieurs fois et mettre au four à > 240ºC pendant au moins quatre heures avant de les utiliser).

Note 3 : Tous les réactifs, ainsi que l'eau libre de DNase/RNase, les embouts de pipette et tout autre matériel qui entre en contact avec les échantillons ou les réactifs de la TI-ACP doivent être stériles ou passés à l'autoclave avant leur utilisation pour éliminer toute DNase et/ou autre contaminant. Pour éviter tout problème de contamination, préparer tous les réactifs dans une hotte à flux laminaire qui n'a jamais été exposée aux NoV ou aux produits des NoV par la TI ACP. Pour éviter toute amplification non spécifique, préparer le mélange en plaçant tous les réactifs sur glace ou sur un plateau réfrigéré. Centrifuger avant l'amplification d'ACP.

Note : Afin de compenser pour toute variation de fluorescence non liée à l'ACP, certains thermocycleurs spectrofluorométriques peuvent exiger l'utilisation de ROX™ comme colorant de référence passif. Si ROX™ est utilisé à cette fin, le diluer 1:500 dans de l'eau libre de nucléase de qualité ACP avant son utilisation.

Composantes de la de la TI-ACP	Concentration initiale	Solutions mères requises pour 102 réactions à l'aide du système Kageyama pour les NoV de GI	Volume par tube	Concentration finale
Eau libre de RNase		1 362,25 µl	12,375 µl
Tampon de base de la TI-ACP 10 X	10 X	255,0 µl	2,5 µl	1 X
Chlorure de magnésium 50 mM	255,0 µl	2,5 µl	5,0 mM
Amorce COG1F	10 µM	102,0 µl	1,0 µl	0,4 µM
Amorce COG1R	10 µM	102,0 µl	1,0 µl	0,4 µM
Sonde RING1(a)	10 µM	76,5 µl	0,75 µl	0,3 µM
Sonde RING1(b)	10 µM	25,5 µl	0,25 µl	0,1 µM
Mélange dNTP	20 mM (5 mM de chaque dNTP)	102,0 µl	1,0 µl	800 µM
Transcriptase inverse		102,0µl	1,0 µl
Colorant de référence 1 mM (ROX™)	Dilué 2 µM	38,25 µl	0,375 µl	0,03 µM
Polymérase d'ADN SureStart® Taq	5 U/µl	25,5 µl	0,25 µl	0,05 U/µl
Volume total		2 346,0 µl	23,0 µl
Distribuer par tube		23,0 µl
Gabarit par tube			2,0 µl

Note : Si ROX™ n'est pas utilisé comme colorant de référence passif, le remplacer par un volume équivalent d'eau libre de RNase.

Note : Afin de compenser pour toute variation de fluorescence non liée à l'ACP, certains thermocycleurs spectrofluorométriques peuvent exiger l'utilisation de ROX™ comme colorant de référence passif. Si ROX™ est utilisé à cette fin, le diluer 1:500 dans de l'eau libre de nucléase de qualité ACP avant son utilisation.

Composantes de la de la TI-ACP	Concentration initiale	Solutions mères requises pour 102 réactions à l'aide du système Kageyama pour les NoV de GII	Volume par tube	Concentration finale
Eau libre de RNase		1 338,75 µl	13,125 µl
Tampon de base de la TI-ACP 10 X	10 X	255,0 µl	2,5 µl	1 X
Chlorure de magnésium	50 mM	255,0 µl	2,5 µl	5,0 mM
Amorce COG2F	10 µM	102,0 µl	1,0 µl	0,4 µM
Amorce COG2R	10 µM	102,0 µl	1,0 µl	0,4 µM
Sonde RING2	10 µM	25,5 µl	0,25 µl	0,1 µM
Mélange dNTP	20 mM (5 mM de chaque dNTP)	102,0 µl	1,0 µl	800 µM
Transcriptase inverse		102,0 µl	1,0 µl
Colorant de référence 1 mM (ROX™)	Dilué 2 µM	38,25 µl	0,375 µl	0,03 µM
Polymérase d'ADN SureStart® Taq	5 U/µl	25,5 µl	0,25 µl	0,05 U/µl
Volume total		2 346,0 µl	23,0 µl
Distribuer par tube		23,0 µl
Gabarit par tube			2,0 µl

Note : Si ROX™ n'est pas utilisé comme colorant de référence passif, le remplacer par un volume équivalent d'eau libre de RNase.

11. Préparation du clone d'adnc pour la courbe d'étalonnage de la TI-ACP en temps réel

11.1 Production du fragment d'ADNc par de la TI-ACP conventionnelle

11.1.1 Amplifier l'ARN des NoV avec les amorces des NoV en temps réel ((GI : COG1F et COG1R; GII : COG2F et COG2R)) à l'aide de la trousse de la TI-ACP Qiagen® OneStep et le programme de la TI-ACP décrit à la section 9.2.

11.1.2 Ajouter 10,0 µl d'échantillon d'ARN des NoV dans 40,0 µl de mélange de réaction de la TI-ACP conventionnelle.

Note : Doubler la recette décrite dans la section 9.3.

11.1.3. Une fois la TI-ACP complétée, analyser le produit de la TI-ACP par électrophorèse sur gel d'agarose (voir la section 7.6). Si nécessaire, les amplicons peuvent être entreposés à 4°C.

11.1.4 Préparer l'échantillon pour l'électrophorèse : dans un microtube propre, mélanger 4,0 µl de colorant de repérage (tampon -de largage 10 X) et 40 µl du produit de la TI-ACP. Les amplicons (produits de la TI-ACP) générés par les amorces des NoV de GI et de GI sont des fragments d'ADN à double brin de 85 bp et 98 bp, respectivement.

11.2 Purification du produit de la TI-ACP à l'aide de la trousse d'extraction de gel QIAquick® (8.13)

Note : Tous les réactifs utilisés dans cette section sont inclus dans la trousse, sauf pour l'éthanol (96 à 99 %). Le protocole de purification du produit de la TI-ACP a été mis au point selon les instructions du fabricant également incluses dans la trousse. Ajouter de l'éthanol (96 à 99 %) au tampon PE avant l'utilisation. Il est primordial de suivre à la lettre les plus récentes instructions du fabricant qui accompagnent la trousse d'extraction de gel QIAquick®. Les instructions les plus à jour du fabricant auront toujours préséance sur les présentes.

11.2.1 À l'aide d'un scalpel propre et bien affuté, exciser le fragment d'ADN du gel d'agarose. Minimiser l'épaisseur de la tranche de gel en supprimant l'excédent d'agarose.

11.2.2 Peser la tranche de gel dans un microtube transparent. Ajouter 6 volumes de tampon QG pour 1 volume de gel (100 mg ~ 100 µl).

11.2.3 Incuber à 50°C pendant 10 minutes ou jusqu'à ce que la tranche de gel soit complètement dissoute. Pour bien dissoudre le gel, homogénéiser le tube à l'aide du mélangeur Vortex aux 2 à 3 minutes pendant l'incubation.

Note : Solubiliser complètement l'agarose. Il sera peut-être nécessaire de prolonger la période d'incubation pour les gels de 3 %.

11.2.4 Lorsque la tranche de gel est complètement dissoute, confirmer que la couleur du mélange est jaune (même couleur que le tampon QG sans agarose dissout). Si le mélange est de couleur orange ou violette, ajouter 10 µl d'acétate de sodium 3 M, pH 5,0, et mélanger. La couleur du mélange passera au jaune.

Note : L'adsorption d'ADN sur la membrane QIAquick® est efficace seulement à un pH =7,5. Le tampon QG contient un indicateur de pH jaune à un pH =7,5 et orange ou violet à un pH plus élevé, pour faciliter la détermination du pH optimal pour la fixation d'ADN.

11.2.5 Ajouter un volume d'isopropanol équivalent au volume de gel initial et mélanger.

11.2.6 Placer une colonne QIAquick® dans un tube collecteur de 2 ml (fourni).

11.2.7 Pour fixer l'ADN, appliquer l'échantillon sur la colonne QIAquick®, puis centrifuger pendant 1 minute à 17 900 x g (13 000 r/min) dans une centrifugeuse de table conventionnelle à la température ambiante (23°C +/- 3°C). Le volume maximum du réservoir de la colonne est 800 µl. Pour tout volume d'échantillon supérieur à 800 µl, répéter l'tape de chargement et centrifugation.

11.2.8 Jeter le filtrat et replacer la colonne QIAquick® dans le même tube collecteur. Les tubes collecteurs sont réutilisés pour réduire le gaspillage d'articles en plastique.

11.2.9 Ajouter 0,5 ml de tampon QG dans la colonne QIAquick® et centrifuger pendant 1 minute à 17 900 x g (13 000 r/min).

11.2.10 Pour laver, ajouter 0,75 ml de tampon PE dans la colonne QIAquick® et centrifuger pendant 1 minute à 17 900 x g (13 000 r/min).

11.2.11 Jeter le filtrat et centrifuger la colonne QIAquick® pendant 1 minute supplémentaire à 17 900 x g (13 000 r/min).

Note : L'éthanol résiduel du tampon PE ne sera pas complètement éliminé, sauf si le filtrat est jeté avant cette centrifugation supplémentaire.

11.2.12 Placer la colonne QIAquick® dans un microtube propre de 1,5 ml.

11.2.13 Pour éluer l'ADN, ajouter 50 µl de tampon EB (Tris•Cl10 mM, pH 8,5) ou d'eau (pH 7,0 à 8,5) au centre de la membrane QIAquick®, laisser reposer pendant 1 minute et centrifuger la colonne à 17 900 x g (13 000 r/min).

Note : Veiller à distribuer le tampon d'élution directement sur la membrane QIAquick® pour assurer l'élution complète de l'ADN fixé. Le volume moyen d'éluat est 48 µl pour un volume de tampon d'élution de 50 µl. L'efficacité de l'élution varie en fonction du pH. L'efficacité maximale d'élution est obtenue à un pH qui se situe entre 7,0 et 8,5. Si de l'eau est utilisée, veiller à ce que son pH soit dans cette plage et entreposer l'ADN à -20°C, car l'ADN peut se dégrader en absence de tampon. L'ADN purifié peut également être élué dans le tampon TE (Tris•Cl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0), mais l'EDTA peut empêcher les réactions enzymatiques subséquentes.

11.2.14 Vérifier l'ADN purifié par électrophorèse sur gel d'agarose (7.6) en ajoutant 9 µl du produit purifié à 1 µl du colorant de repérage (tampon de largage 10 X).

11.3 Réaction de clonage à l'aide de la trousse de clonage TA de TOPO® et transformation des cellules compétentes (8.15)

Note 1 : Tous les réactifs utilisés dans cette section sont inclus dans la trousse, sauf le milieu LB et les plaques de gélose LB contenant l'antibiotique approprié et le X-Gal. Le protocole de transformation d'E. coli à l'aide de la trousse de clonage TA de TOPO® a été mis au point selon les instructions du fabricant qui accompagnent la trousse. Il est primordial de suivre à la lettre les plus récentes instructions du fabricant qui accompagnent la trousse d'extraction de clonage TA de TOPO®. Les instructions les plus à jour du fabricant auront toujours préséance sur les présentes.

Note 2 : La transformation d'E. coli peut être effectuée par procédé chimique ou par électroperméabilisation. Le manuel d'utilisateur d'Invitrogen traite de la transformation chimique.

11.3.1 Immédiatement avant de commencer, réchauffer la fiole de milieu S.O.C à la température ambiante (23°C +/- 3°C).

11.3.2 Réchauffer les plaques sélectives (plaque LB contenant 50 µg/ml de kanamycine) à 37°C pendant 30 min.

11.3.3 Étendre 40 µl de X-Gal (40 mg/ml dans du N,N-diméthylformamide (DMF)) sur chaque plaque de gélose LB et incuber à 37°C jusqu'au moment de l'utilisation.

11.3.4 Placer les cuvettes d'électroperméabilisation sur la glace.

11.3.5 Dégeler sur glace 1 fiole de cellules E coli électrocompétentes (One Shot® TOP10).

11.3.6 Diluer la solution saline au quatrième en ajoutant 15 µl d'eau à 5 µl de solution saline.

11.3.7 Préparer la réaction de clonage TOPO® en ajoutant 4 µl du produit d'ACP purifié à 1 µl de la solution saline diluée et 1 µl du vecteur PCR®2.1-TOPO®.

11.3.8 Mélanger doucement et incuber pendant 5 minutes à la température ambiante.

11.3.9 Placer la réaction sur glace.

11.3.10 Ajouter 2 µl de la réaction de clonage TOPO® dans une fiole de cellules E coli électrocompétentes (One Shot® TOP10) et mélanger doucement.

Note : Ne pas mélanger à l'aide de la pipette.

11.3.11 Transférer soigneusement la solution dans une cuvette de 0,1 cm pour éviter toute formation de bulles.

11.3.12 Électroperméabiliser l'échantillon en suivant votre propre protocole et à l'aide de l'électroperméabilisateur.

11.3.13 Ajouter immédiatement 250 µl de milieu S.O.C conservé à la température ambiante.

11.3.14 Transférer la solution dans un tube à bouchon pressoir de 15 ml (p. ex. Falcon) et mélanger pendant au moins 1 heure à 37°C pour permettre l'expression des gènes de résistance aux antibiotiques.

11.3.15 Étendre entre 10 et 50 µl de chaque transformation sur une plaque LB préchauffée contenant du X-Gal et de la kanamycine (50 µg/ml) et incuber pendant la nuit à 37°C.

11.3.16 Prélever 10 colonies blanches et les cultiver pendant la nuit à 37°C dans 5 ml de milieu LB contenant de la kanamycine (50 µg/ml).

11.3.17 Isoler l'ADN du plasmide pour confirmer la présence de l'insert des NoV.

11.4 Isolation de l'ADN du plasmide d'E. coli à l'aide de la trousse de plasmides NucleoSpin® (8.9)

Note : Tous les réactifs utilisés dans cette section sont inclus dans la trousse, sauf l'éthanol (96 à 99 %) et les microtubes de 1,5 ml. Le protocole d'isolation de l'ADN du plasmide d'E. coli a été mis au point selon les instructions du fabricant qui accompagnent la trousse. Il est primordial de suivre à la lettre les plus récentes instructions du fabricant qui accompagnent la trousse de plasmide NucleoSpin®. Les instructions les plus à jour du fabricant auront toujours préséance sur les présentes.

Avis de sécurité : Les tampons A3 et AW contiennent du monochlorhydrate de guanidine, une substance très toxique. Adopter les mesures de sécurité appropriées et porter des gants pour les manipuler. Jeter toutes les solutions, ainsi que tous les tampons et les réactifs conformément aux lignes directrices sur l'élimination des déchets.

11.4.1 Avant de commencer, ajouter tout le contenu de la fiole de RNase A (fournie) dans la bouteille de tampon A1. Bien mélanger et entreposer à 4°C pendant au plus 6 mois.

11.4.2 Ajouter de l'éthanol (96 à 99 %) non dénaturé au tampon A4 avant de l'utiliser. Le volume approprié d'éthanol est imprimé sur la bouteille du tampon A4.

11.4.3 À l'aide d'une pipette, ajouter 1,5 ml de culture saturée d'E. coli et centrifuger à 11 000 x g pendant 30 secondes pour sédimenter les cellules bactériennes.

11.4.4 Jeter le surnageant.

11.4.5 Remettre le culot en suspension dans 250 µl de tampon A1 en homogénéisant vigoureusement à l'aide du mélangeur Vortex.

Note : Avant l'utilisation, vérifier le tampon A2 pour confirmer la présence de SDS précipité. Si un précipité blanc est visible, réchauffer le tampon pendant plusieurs minutes à 30 à 40°C jusqu'à dissolution complète du précipité. Refroidir le tampon jusqu'à ce qu'il atteigne la température ambiante (23°C +/- 3°C).

11.4.6 Ajouter 250 µl de tampon A2 dans la suspension. Mélanger doucement en inversant le tube entre 6 et 8 fois, puis incuber à la température ambiante pendant 5 minutes.

Note : Ne pas homogénéiser à l'aide du mélangeur Vortex pour éviter la libération d'ADN chromosomique contaminant dans la suspension.

11.4.7 Ajouter 300 µl de tampon A3 dans la suspension. Mélanger doucement en inversant le tube entre 6 et 8 fois.

11.4.8 Centrifuger la suspension dans un microtube à 11 000 x g pendant 5 minutes. Répéter cette étape, si le surnageant n'est pas transparent.

11.4.9 Placer une colonne NucleoSpin Plus dans un tube collecteur de 2 ml et ajouter le surnageant (étape 11.4.8) dans la colonne.

11.4.10 Centrifuger à 11 000 x g pendant 1 minute et jeter le filtrat.

11.4.11 Laver la colonne NucleoSpin avec 500 µl de tampon AW.

11.4.12 Centrifuger à 11 000 x g pendant 1 minute et jeter le filtrat.

11.4.13 Insérer de nouveau la colonne NucleoSpin dans le tube collecteur de 2 ml et ajouter 600 µL de tampon A4 (avec éthanol) dans la colonne NucleoSpin.

11.4.14 Centrifuger à 11 000 x g pendant 1 minute et jeter le filtrat.

11.4.15 Centrifuger de nouveau à 11 000 x g pendant 2 minutes pour éliminer tout éthanol résiduel de la membrane de silice à l'intérieur de la colonne.

11.4.16 Placer la colonne NucleoSpin dans un microtube de 1,5 ml ou 2 ml (non fourni dans la trousse). Éluer l'ADN en ajoutant 50 µL de tampon AE (Tris-HCl 5 mM, pH 8,5) dans la colonne. Incuber pendant 1 minute à la température ambiante (23°C +/- 3°C).

11.4.17 Centrifuger à 11 000 x g pendant 1 minute. L'ADN du plasmide est alors recueilli dans le tampon AE au fond du microtube à centrifuger.

11.5 Confirmation de la présence de l'insert des NoV

11.5.1 Dans un microtube, ajouter 2,0 µl du plasmide purifié d'ADN (11.4.17), 2,0 µl de tampon d'endonucléase de restriction (fourni avec l'endonucléase de restriction), 15,0 µl d'eau libre de RNase/DNase et 1,0 µl d'endonucléase de restriction EcoRI (10 U/µl).

11.5.2 Incuber pendant la nuit dans un bain-marie ou un bloc chauffant à 37°C.

11.5.3 Une fois la réaction complétée, préparer l'échantillon pour l'électrophorèse. Dans un microtube propre, mélanger 10 µl de plasmide digéré et 1 µl de colorant de repérage (tampon de de largage 10 X). Analyser par électrophorèse tel que décrit à l'étape 7.6.

11.5.4 Les deux fragments d'ADN générés par l'endonucléase de restriction EcoRI sont de taille moléculaire de 3 921 pb (pour le plasmide) et de 95 bp (85 pb pour l'ADNc des NoV de GI produit à l'aide des amorces COG1 + 10 pb pour le plasmide) ou de 3 921 pb (pour le plasmide) et de 108 pb (98 pb pour l'ADNc des NoV de GII cDNA produit à l'aide des amorces COG2 + 10 pb pour le plamide). Par conséquent, les bandes d'une taille moléculaire de 95 pb ou 108 pb, comparativement à un marqueur de taille moléculaire d'ADN (p. ex. marqueur de taille des fragments d'ADN en incréments de 100 pb) analysé sur le même gel, peuvent être confirmées comme étant de l'ADNc des amorces des NoV de GI et/ou GII, respectivement.

Note : Il est cependant conseillé de séquencer l'insert pour confirmer son intégrité. Le gène hybride peut être séquencé à l'aide des amorces sens et antisens M13. Le séquençage de l'ADN peut habituellement être imparti à une université locale; plusieurs sociétés biotechnologiques offrent également un service personnalisé de séquençage. Communiquer avec les auteurs pour obtenir de l'aide à cet égard.

11.6 Linéarisation du plasmide à utiliser comme étalon

11.6.1 Dans un microtube, ajouter 35,0 µl d'ADN plasmidique (11.4.17), 12,0 µl de tampon d'endonucléase de restriction (fourni avec l'endonucléase de restriction), 65,0 µl d'eau libre de RNase/DNase et 10,0 µl d'endonucléase de restriction BamHI (10 U/µl).

11.6.2 Incuber pendant 4 heures dans un bain-marie ou un bloc chauffant à 37°C.

11.6.3 Inactiver l'endonucléase de restriction en l'incubant pendant 20 minutes dans un bain-marie ou un bloc chauffant à 55°C.

11.6.4 Une fois la réaction complétée, préparer l'échantillon pour l'électrophorèse. Dans un microtube propre, mélanger 2,0 µl du produit de plasmide digéré, 8.0 µl d'eau libre de RNase/DNase et 1 µl de colorant de repérage (tampon largage 10 X). Analyser par électrophorèse tel que décrit à la section 7.6.

11.6.5 Le fragment d'ADN généré par l'endonucléase de restriction BamHI est de taille moléculaire de 4 016 pb (3 931 pb pour le plasmide + 85 pb pour l'ADNc des NoV de GI produit à l'aide des amorces COG1) ou de 4 029 pb (3 931 pb pour le plasmide + 98 pb pour l'ADNc des NoV de GII produit à l'aide des amorces COG2).

Note : Une seule bande devrait apparaître sur le gel d'agarose pour confirmer la linéarisation du clone d'ADNc.

11.7 Préparation de la courbe d'étalonnage pour la TI-ACP en temps réel

11.7.1 À l'aide d'un spectrophotomètre, déterminer la concentration en g/µl de votre solution linéaire de plasmide d'ADN (11.6.3).

11.7.2 Déterminer la masse molaire :
Longueur en bp (plasmide + insert des NoV) x 649 g/mol [masse molaire pour 1 kb]
Nov de GI : (3 931 pb + 85 pb) x 649 g/mol = 2,606 X 10⁶ g/mol
NoV de GII : (3 931 pb + 98 pb) x 649 g/mol = 2,615 X 10⁶ g/mol

11.7.3 Déterminer le nombre de copies (équivalents génomiques)/µl :
Nombre de copies/µl = [(concentration du plasmide linéarisé en g/µl) / (masse molaire)] x (6,023 x 10²³)

Exemple : Si la concentration du plasmide linéarisé contenant l'ADNc des NoV de GII est 143,89 ng/µl, alors le nombre est 1,439 X 10^-7 g/µl

Nombre de copies /µl = [(1.439 X 10^-7 g/µl) / (2,615 X 10⁶ g/mol)] x (6,023 x 10²³)
Nombre de copies /µl = 33,144 x 10⁹ ou 3,314 x 10¹⁰

11.7.4 Diluer la suspension de plasmide linéaire dans de l'eau libre de RNase/DNase pour obtenir une concentration de 1 x 109 copies (ou équivalent génomiques)/µl.

11.7.5 Générer les courbes d'étalonnage (voir l'étape 7.4.4).