Techniques moléculaires
Électrophorèse en gel
L'électrophorèse en gel est une technique de base visant à séparer l'ADN, l'ARN ou les protéines. Cette technique est un point de départ courant à un grand nombre d'expériences biotechnologiques et est souvent utilisée conjointement aux techniques de transfert (voir plus loin).
Cette technique fait appel à l'électricité afin de séparer les molécules dans un gel d'agarose, substance épaisse ressemblant à la gélatine. L'ADN, L'ARN et les protéines sont tous chargés électriquement, de sorte que lorsque l'on applique un courant électrique au gel, ces molécules se déplaceront naturellement vers le pôle opposé. Comme il est difficile de se déplacer dans le gel, les molécules se déplaceront à des vitesses variables selon leur taille. Les molécules plus petites se déplaceront plus rapidement et atteindront l'extrémité du gel, tandis que les molécules plus grosses seront ralenties et resteront près du début.
Avec l'électrophorèse en gel, on obtient un gel où les molécules sont réparties sur toute la surface. Si elles sont colorées, les molécules apparaissent comme de courtes bandes à l'œil nu. Le gel peut être utilisé de bien des façons. En faisant l'analyse sur gel de certaines parties du génome, on obtient un modèle qui est unique pour toutes les personnes, et cette analyse peut être utilisée afin de faire l'empreinte génétique. Les gels servent également à déceler la présence ou l'absence de molécules d'ADN ou d'ARN particuliers ou de protéines, lorsqu'ils sont combinés aux techniques de transfert.
Les techniques de transfert
Les transferts de Southern, de Northern et de Western sont utilisés afin de dépister respectivement l'ADN, l'ARN messager (ARNm) et les protéines. Le transfert fait référence à la technique actuelle selon laquelle les molécules ont été séparées sur un gel et transférées sur un papier appelé nitrate de cellulose. M. Edward Southern a conçu la technique de transfert d'ADN et y a donné son nom, et le nom des techniques de transfert Northern et Western en ont découlé.
Transfert de Southern
Avant de pouvoir procéder au transfert lui-même, l'ADN qui a été coupé avec des enzymes de restriction est séparé par l'électrophorèse sur gel (voir précédemment). Pour l'étape du transfert, le gel est placé sur une éponge qui se trouve dans une solution tampon. Le papier de nitrate de cellulose où l'ADN sera transféré est placé au-dessus du gel puis recouvert de papier essuie-tout et d'un poids. Le transfert de l'ADN du gel au papier se fait par capillarité, alors que la solution tampon imbibe les essuie-tout secs. Après plusieurs heures, le transfert est complété et les fragments d'ADN présents sur le papier sont dans la même position qu'ils étaient dans le gel. Le papier peut ensuite être incubé avec une sonde propre au fragment d'ADN étudié. La sonde est étiquetée de façon radioactive et, une fois l'incubation terminée, l'ADN peut être identifiée par audiographie. Il faut utiliser des contrôles afin de s'assurer que l'électrophorèse et le transfert ont réussi. La comparaison des modèles de bande par audiographie permet d'établir la présence ou l'absence de l'ADN étudié.
Transfert de Northern
On fait le transfert de Northern de la même façon que le transfert de Southern, mais on utilise l'ARNm au lieu de l'ADN.
Transfert de Western
Le transfert de Western fait également appel à la même procédure que le transfert de Southern, mais il sert plutôt à déceler les protéines et non l'ADN. Après le transfert des protéines sur le papier, on utilise des anticorps afin d'en établir la présence. L'anticorps principal se fixe à la protéine présente sur le papier et l'anticorps secondaire se fixe à l'anticorps principal. L'anticorps secondaire est soit étiqueté par une couleur soit lié à un enzyme qui peut produire une couleur afin de cerner où il se trouve sur le papier.
Dosage immunoenzymatique (ELISA)
La technique ELISA sert à dépister la présence d'anticorps ou d'antigènes particuliers dans un échantillon. Elle est très simple et permet d'analyser un grand nombre d'échantillons à la fois, ce qui en fait une technique de diagnostic très importante.
La méthode ELISA tire avantage de la propriété naturelle des antigènes et des anticorps de se lier ensemble. Dans un récipient de plastique à puits multiples, on place l'anticorps d'un antigène particulier. On ajoute ensuite un échantillon différent à chacun des puits, par exemple des échantillons de sang de personnes différentes. Plusieurs puits contiendront des échantillons de contrôle positif et négatif. Si les antigènes du sang correspondent aux anticorps présents dans les puits, ils se fixeront ensemble. Les antigènes qui ne se fixent pas seront éliminés. On ajoute alors un deuxième anticorps aux puits qui se fixe uniquement aux antigènes. Ce deuxième anticorps se fixera à un enzyme qui produira une couleur lorsque l'on y ajoute une solution. On peut ensuite faire la lecture de l'ensemble du récipient à l'aide d'un appareil à balayage qui cherche la présence de la couleur de l'enzyme. Si la couleur est présente, cela signifie que l'échantillon contenait l'antigène cherché. S'il n'y a pas de couleur, aucun antigène ne s'est fixé au premier anticorps. Les échantillons de contrôle servent à s'assurer que la procédure a réussi, le contrôle positif devant être coloré et le contrôle négatif ne l'étant pas.
Réaction de polymérisation en chaîne (PCR)
La technique PCR sert à faire des milliers de copie d'un fragment d'ADN en quelques minutes au moyen d'un enzyme appelé polymérase. La technique joue un rôle important en recherche, en diagnostic et en sciences légales.
Afin d'utiliser la technique PCR en vue d'amplifier un fragment d'ADN, il faut tout d'abord connaître les séquences d'ADN se trouvent aux deux extrémités du fragment. Les scientifiques doivent faire des copies complémentaires de l'ADN qui se trouve dans ces zones, appelées amorces. Les amorces disent à la polymérase de l'ADN où commencer à copier l'ADN et où arrêter. En plus des amorces, une copie du fragment d'ADN devant être copié, les nucléotides et la polymérase de l'ADN sont mélangés dans un petit tube et placés dans un appareil qui surveille étroitement la température. Les changements particuliers de la température sont essentiels au processus de PCR.
Au départ, la température est de 96 °C, ce qui permet la dénaturation ou la séparation des deux fragments d'ADN. Vient ensuite l'étape de la renaturation, au cours de laquelle les amorces se fixent aux fragments d'ADN. Cette étape se produit à 68 °C. Après la renaturation des amorces, la polymérase de l'ADN les copie en y ajoutant des nucléotides selon le modèle d'ADN, et ce, à une température de 72 °C. Chacun des cycles de trois étapes est réalisé en moins de deux minutes et peut être répété de nombreuses fois afin de produire des milliers de copies du fragment d'ADN original.
La technique PCR peut être utilisée à diverses fins, comme la réalisation d'empreinte génétique dans le domaine de la science légale, les recherches de paternité, le dépistage de mutation de maladies et le clonage de gènes pour la recherche.
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